DNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate(脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫(xiě)，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱(chēng)，N是指含氮堿基，代表變量指代A、T、G、C等中的一種。在生物DNA合成中，以及各種PCR(RT-PCR(reverse transcription PCR)、Real-time PCR)中起原料作用。這些化合物屬于大極性化合物，常規(guī)的反相色譜柱通常難以保留，而使用離子對(duì)試劑，方法的耐用性會(huì)受到挑戰(zhàn)。
Hypercarb 填料為100% 的多孔石墨化碳(PGC)，球形全多孔顆粒。碳原子排列成六邊形為骨架的多片層結(jié)構(gòu)，因此，填料表面為純晶狀結(jié)構(gòu)，沒(méi)有任何其它的亞孔或鍵合相?；谶@一特點(diǎn)，Hypercarb色譜柱具有不同于硅膠基質(zhì)固定相的獨(dú)特性質(zhì)。Hypercarb 對(duì)各種流動(dòng)相溶劑都表現(xiàn)出極佳的穩(wěn)定性，pH 在 1-14 之間的流動(dòng)相皆可用于分離?；贖ypercarb 獨(dú)特的疏水和電子云保留機(jī)理，它非常適合解決反相和正相 HPLC 及 LC/MS 應(yīng)用中的“高挑戰(zhàn)樣品”分離，能夠以超凡能力保留強(qiáng)極性目標(biāo)物并分離結(jié)構(gòu)性質(zhì)接近的化合物。
本文采用黑科技Hypercarb色譜柱，在堿性流動(dòng)相條件下，能夠充分保留和分離dNTP 4種化合物以及dCTP有關(guān)雜質(zhì)，重現(xiàn)性佳，同時(shí)對(duì)于類(lèi)似結(jié)構(gòu)的極性化合物分離具有重大的參考意義。
實(shí)驗(yàn)方法
液相色譜方法
儀器：Vanquish Core HPLC
色譜柱：Hypercarb，150 x 2.1 mm，3 μm(P/N 35003-152130)
流動(dòng)相：A：己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸調(diào)pH=10 B: 乙腈
流 速：0.3 mL/min
柱 溫：30 ℃
進(jìn)樣量：5 μL
檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 254/272 nm
具體梯度條件參見(jiàn) AN_24053_CCS
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
dNTP 4種化合物分析
dNTPs是包含核苷和三磷酸基團(tuán)的大極性化合物，如使用反相色譜柱，流動(dòng)相添加離子對(duì)試劑是比較復(fù)雜的方法，同時(shí)不利于色譜柱壽命；在此之前，基于Hypercarb色譜柱耐受寬pH值(1-14)的特點(diǎn)， Hypercarb已成功應(yīng)用于堿性條件下分析核苷酸和阿糖胞苷類(lèi)化合物等含有單磷酸或者多磷酸基團(tuán)的大極性化合物[1]，此方案同樣考慮在堿性條件下保留和分離dNTPs。
參考阿糖胞苷測(cè)試方法，流動(dòng)相A為己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸調(diào)pH=10，流動(dòng)相B為乙腈。圖1展示了優(yōu)化后梯度下的4種化合物單標(biāo)定位譜圖。
圖1. 4種dNTP化合物單標(biāo)定位譜圖
圖2展示了dNTP 4種化合物重復(fù)性譜圖，連續(xù)6針，4種化合物保留時(shí)間和峰面積RSD均小于1%。
圖2. dNTP 4種化合物重復(fù)性譜圖(n=6)
在不同波長(zhǎng)下分析dNTP 4種化合物，如圖3所示，濃度均為50μM ，dCTP和dTTP在波長(zhǎng)為272nm時(shí)響應(yīng)更高，而dGTP和dATP在波長(zhǎng)為254nm時(shí)響應(yīng)更高，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求選擇更合適的波長(zhǎng)進(jìn)行分析。
圖3. 不同波長(zhǎng)下dNTP 4種化合物響應(yīng)譜圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
dCTP及相關(guān)雜質(zhì)分析
當(dāng)dCTP濃度為2.5 mM時(shí),通過(guò)優(yōu)化水相起始比例和梯度方法， dCTP和相關(guān)雜質(zhì)均可以分離，峰型較好。對(duì)dCTP及相關(guān)雜質(zhì)在Hypercarb色譜柱上保留和分離的重復(fù)性進(jìn)行了研究，如圖4所示，連續(xù)3針進(jìn)樣，重復(fù)性表現(xiàn)優(yōu)異，保留時(shí)間和峰面積RSD<1%。圖5展示了不同波長(zhǎng)下dCTP及相關(guān)雜質(zhì)響應(yīng)譜圖，可以看到272nm下，二磷酸雜質(zhì)和dCTP主峰響應(yīng)更高。
圖4. dCTP及相關(guān)雜質(zhì)重復(fù)性譜圖(n=3)
圖5. 不同波長(zhǎng)下dCTP及相關(guān)雜質(zhì)響應(yīng)譜圖
使用及維護(hù)
Hypercarb色譜柱使用及維護(hù)
Hypercarb色譜柱使用方法和反相色譜柱類(lèi)似，但是由于其特殊的保留機(jī)理，流動(dòng)相添加劑和污染物容易吸附在石墨化碳表面，需要及時(shí)對(duì)色譜柱進(jìn)行清洗。本方案中，最高有機(jī)相比例為30%，需要定期使用高有機(jī)相沖洗色譜柱，一般建議80%乙腈沖洗20個(gè)柱體積以上。如果長(zhǎng)時(shí)間使用后污染較為嚴(yán)重，可以反接色譜柱，使用純乙腈低流速75℃柱溫下沖洗120個(gè)柱體積以上[2]。
總結(jié)
為解決dNTPs 以及dCTP有關(guān)雜質(zhì)這些大極性化合物的保留和分離問(wèn)題，本文基于賽默飛 Vanquish Core HPLC液相色譜系統(tǒng)，應(yīng)用Hypercarb色譜柱的特殊保留機(jī)理，開(kāi)發(fā)了堿性流動(dòng)相條件下的分離方案。該方案操作簡(jiǎn)單，分離效果佳，重現(xiàn)性?xún)?yōu)異，可為實(shí)驗(yàn)室保留分離同類(lèi)型化合物提供參考方案，為分析人員帶來(lái)極大便利。
參考文獻(xiàn)：
[1] AN_21025_CCS_藥物_Hypercarb色譜柱用于核苷酸類(lèi)及其磷酸化衍生物的分析
[2] ThermoFisher Scientific Hypercarb色譜柱方法開(kāi)發(fā)指南
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