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　　使用說(shuō)明：
　　
　　1.準(zhǔn)備溶液：溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽
　　
　　提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試
　　
　　劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
　　
　　2.對(duì)于貼壁細(xì)胞：用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，
　　
　　并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用*
　　
　　消化細(xì)胞，以免*降解需抽提的目的蛋白。
　　
　　3.對(duì)于懸浮細(xì)胞：用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
　　
　　4.每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。（對(duì)于二百萬(wàn)Hela細(xì)胞，其細(xì)胞
　　
　　沉淀的體積大約為20微升或40毫克。）
　　
　　5.zui高速劇烈Vortex5秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開(kāi)。（如果細(xì)胞沉淀沒(méi)有*懸浮并分散開(kāi)，可
　　
　　以適當(dāng)延長(zhǎng)vortex時(shí)間。）
　　
　　6.冰浴10-15分鐘。
　　
　　7.加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B10微升。zui高速劇烈Vortex5秒，冰浴1分鐘。
　　
　　8.zui高速劇烈Vortex5秒，4℃12,000-16,000g離心5分鐘。
　　
　　9.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以凍存。（千
　　
　　萬(wàn)不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）
　　
　　10.對(duì)于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。（不吸盡上清會(huì)
　　
　　帶來(lái)細(xì)胞漿蛋白的污染。）
　　
　　11.zui高速劇烈Vortex15-30秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開(kāi)。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速
　　
　　劇烈Vortex15-30秒，共30分鐘。
　　
　　12.4℃12,000-16,000g離心10分鐘。
　　
　　13.立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以-70℃凍
　　
　　存。
　　
　　14.對(duì)于新鮮組織：
　　
　　A.把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B（例
　　
　　如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B）。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成
　　
　　組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃
　　
　　勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。
　　
　　B.勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。
　　
　　C.4℃1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。（吸上
　　
　　清時(shí)千萬(wàn)不要觸及沉淀。）
　　
　　D.對(duì)于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒(méi)有破碎。接下去按照使用說(shuō)明的步驟4開(kāi)
　　
　　始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋
　　
　　白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。