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重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹
重組蛋白表達(dá)服務(wù)
原核蛋白表達(dá)服務(wù)
穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)
分離純化處于重組蛋白表達(dá)的下游處理（downstream processing）階段，且與上游過程緊密相聯(lián)，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)等。所以在對目的蛋白表達(dá)純化時，要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計，并充分考慮上游對下游的影響。同時，不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法也影響下游的處理過程：目的蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目的蛋白表達(dá)定位（胞內(nèi)、細(xì)胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和細(xì)胞外）
重組蛋白表達(dá)策略
表達(dá)策略優(yōu)點缺點
分泌表達(dá)至細(xì)胞外 增強(qiáng)正確二硫鍵的形成
降低蛋白酶對表達(dá)蛋白的降解
可獲得確定的N末端
顯著減少雜蛋白水平，簡化純化
不需要細(xì)胞破碎 表達(dá)水平低
多數(shù)蛋白不能進(jìn)行分泌表達(dá)
表達(dá)蛋白需要濃縮 
細(xì)胞周質(zhì)空間表達(dá) 增強(qiáng)二硫鍵正確形成
可獲得確定N末端
顯著減少雜蛋白水平，簡化純化 一些蛋白不能分泌進(jìn)入周質(zhì)空間
沒有大規(guī)模選擇性地釋放周質(zhì)空間蛋白的技術(shù)
周質(zhì)蛋白酶可引起重組蛋白的酶解 
細(xì)胞內(nèi)包涵體表達(dá) 包涵體易于分離
保護(hù)蛋白質(zhì)不被降解 需要體外的折疊和溶解，得率較低
具有不確定N末端 
細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)不具有活性，對宿主細(xì)胞生長沒有大影響
通常可獲得高表達(dá)水平
不需要體外溶解和折疊
一般具有正確的結(jié)構(gòu)和功能 高水平的表達(dá)難以得到
需要復(fù)雜的純化
可發(fā)生蛋白質(zhì)酶解
具有不確定N末端 
由上表可知選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可避免破碎細(xì)胞的步驟，而且細(xì)胞外和周質(zhì)空間內(nèi)的蛋白種類較少，目的蛋白易純化；而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)重組蛋白時，重組蛋白通常是可溶性表達(dá)，但也易形成包涵體?？扇苄缘鞍淄枰獜?fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離且純度較高，但回收具有生物活性的蛋白質(zhì)卻變得相當(dāng)困難，通常需要對聚集的蛋白進(jìn)行變，復(fù)性，而通常情況下活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借多年的蛋白表達(dá)服務(wù)操作經(jīng)驗和相關(guān)的技術(shù)，可以提供可溶性重組蛋白保證型服務(wù)和更高純度的上清蛋白。
色譜法分離純化蛋白質(zhì)
色譜法又稱層析法，是利用不同物理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的色譜系統(tǒng)都由倆個相組成：固定相（固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分）和流動相（水和其他溶劑）。當(dāng)待分離的混合物隨流動相通過固體相時，各組分與倆相發(fā)生相互作用（吸附，溶解，結(jié)合）并因作用力的不同導(dǎo)致流出時間上的差異，分部收集流出液，可以得到樣品中所含的各單一組分，從而達(dá)到分離各組分的目的。
色譜層析分離純化蛋白質(zhì)有多種方法，包括凝膠過濾色譜，離子交換色譜，親和色譜，疏水色譜液相色譜等。其中親和色譜在重組蛋白純化中的應(yīng)用廣泛。
分離純化原則總結(jié)：
應(yīng)盡可能利用蛋白質(zhì)不同物理特性選擇所用的分離純化技術(shù)，而不是利用相同技術(shù)多次純化；
不同的蛋白在性質(zhì)上有很大區(qū)別，每一步純化步驟都應(yīng)當(dāng)充分利用目的蛋白和雜質(zhì)成分物理性質(zhì)差異；
在純化早期階段要盡量減少處理體積，方便后續(xù)純化；
在純化后期階段，再使用造價高的純化方法，有利于純化材料的重復(fù)使用，減少再生復(fù)雜性。
親和色譜
親和色譜是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有的特異性親和力，從而達(dá)到分離的目的。即將一對能可逆結(jié)合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱，使得樣品混合物流經(jīng)色譜柱時，與親和配基能結(jié)合的物質(zhì)就被選擇性地吸附下來，而其他的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，從色譜柱中流出，使用適當(dāng)?shù)木彌_液使被分離物質(zhì)與配基解吸附，即可獲得純化的目的產(chǎn)物。
親和色譜具有高選擇性，高分辨率和高容量的特點，并且親和色譜純化過程簡單，迅速，且分離效率高。并且可用于純化生物大分子、稀溶液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白的貯藏、從純化分子中除去殘余污染物等。但其需要針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求穩(wěn)定色譜的條件，且成本較高。（查看完整親和色譜純化方法介紹）
實驗案例（從E.coli 中提取誘導(dǎo)表達(dá)的GST 標(biāo)簽融合蛋白）
案例簡介
S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和標(biāo)簽是純化重組蛋白的常用方法，該方法以GST 能夠偶聯(lián)在介質(zhì)上的配體結(jié)合為基礎(chǔ)。同時，帶有GST 的蛋白與配體結(jié)合是可逆的，能夠在溫和，非變性的條件下通過加入還原型被洗脫下來。
實驗材料
BL21 感受態(tài)細(xì)胞、PGEX 表達(dá)載體、LB 培養(yǎng)基、Amp（氨芐）、IPTG、蛋白酶控制劑、緩沖液1（100mmol/L Tris，PH 8.5，500mmol/L NaCl）、緩沖液2（100mmol/L NaAc，PH 4.5，500mmol/L NaCl）、PBS 緩沖液（100mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4）、洗脫緩沖液（50mmol/L Tris，PH 8.0,10mmol/L GSH）、微量紫外分光光度計、超聲波破碎儀、高速冷凍離心機(jī)、GST 柱。

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