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| 隨著2010版GMP的頒布和進(jìn)一步實(shí)施，無(wú)菌藥品生產(chǎn)中“除菌過(guò)濾工藝”的風(fēng)險(xiǎn)管理和驗(yàn)證受到制藥行業(yè)的極大關(guān)注。除菌過(guò)濾器提供商提供的《標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證指南》（Validation Guide）為過(guò)濾器的驗(yàn)證提供標(biāo)準(zhǔn)，包括實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的測(cè)試數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)值。例如：過(guò)濾器耐受滅菌的時(shí)間和次數(shù)、過(guò)濾器耐受的zui高溫度和zui大壓差、化學(xué)兼容性；過(guò)濾器溶出物和生物安全性測(cè)試，以及該條件下細(xì)菌挑戰(zhàn)測(cè)試和完整性測(cè)試參數(shù)等。 3M《標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證指南》對(duì)過(guò)濾器驗(yàn)證項(xiàng)目做了詳盡描述，通過(guò)嚴(yán)格驗(yàn)證確保過(guò)濾器應(yīng)用和性能的一致性和穩(wěn)定性，做到除菌過(guò)濾工藝的*。而對(duì)于具體藥液中的除菌過(guò)濾，溶劑、溫度、壓力、過(guò)濾時(shí)間等都與實(shí)驗(yàn)室條件不同，則必須按照GMP的要求，進(jìn)行工藝條件下的“再驗(yàn)證”。驗(yàn)證內(nèi)容包括但不于，藥液對(duì)除菌過(guò)濾器的影響：化學(xué)相容性試驗(yàn)（Compatibility testing）和完整性試驗(yàn)（Product-wet integrity test）；除菌過(guò)濾器對(duì)料液的影響：溶出物試驗(yàn) （Extractable testing）和吸附試驗(yàn)（Adsorption testing）；藥液對(duì)除菌過(guò)濾器細(xì)菌截留率的影響：細(xì)菌存活試驗(yàn)（Bacterial viability testing ）和細(xì)菌截留試驗(yàn) （Bacterial challenge testing ）。限于篇幅，本文結(jié)合理論和實(shí)際，重點(diǎn)介紹細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)的原理和方法，為細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)參考和理論依據(jù)。 除菌過(guò)濾工藝 除菌過(guò)濾的目的是從原料藥液里通過(guò)過(guò)濾去除細(xì)菌。如果產(chǎn)品無(wú)法進(jìn)行zui終滅菌，需要采用0.22mm（更小或相同過(guò)濾效力）的除菌過(guò)濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾。新版GMP附錄1 “第十三章，非zui終滅菌產(chǎn)品的過(guò)濾”第九十一條規(guī)定，與其他滅菌方法相比，除菌過(guò)濾的風(fēng)險(xiǎn)zui大，因此，宜安裝第二只已滅菌的除菌過(guò)濾器再過(guò)濾一次藥液。圖一為除菌過(guò)濾工藝的工藝流程示意圖，澄清過(guò)濾一般采用深層濾芯，去除料液中的不純物質(zhì)，降低料液濁度和生物負(fù)荷度。無(wú)菌過(guò)濾點(diǎn)采用預(yù)過(guò)濾與除菌過(guò)濾組合的方式確保除菌效率和濾芯過(guò)濾性能的穩(wěn)定性。法規(guī)要求的*個(gè)要點(diǎn)是在采用除菌過(guò)濾方法時(shí)，首先確認(rèn)采用的過(guò)濾器為“除菌級(jí)”，達(dá)到此要求后，除菌過(guò)濾法中的其它無(wú)菌保障措施才有意義。定義過(guò)濾器是否為除菌級(jí)，需要依靠過(guò)濾器的微生物截留能力，并完成相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證和工藝驗(yàn)證。目前業(yè)界缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量孔徑，孔徑的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)預(yù)測(cè)微生物截留和比較不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的過(guò)濾器沒(méi)有實(shí)際的意義，因而，需要用微生物截留能力來(lái)定義除菌級(jí)過(guò)濾器（2010版-無(wú)菌制劑GMP實(shí)施指南）。以此可以看出細(xì)菌截留試驗(yàn)對(duì)于除菌濾芯驗(yàn)證的重要性。細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 新版GMP實(shí)施指南中提到除菌級(jí)過(guò)濾器驗(yàn)證的兩個(gè)主要因素：一是濾膜的級(jí)別，要求可適用的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)或類似的方法以細(xì)菌挑戰(zhàn)的方式進(jìn)行；二是工藝驗(yàn)證，由過(guò)濾器的使用者或指派的實(shí)驗(yàn)設(shè)施（例如，過(guò)濾器的生產(chǎn)者或協(xié)議實(shí)驗(yàn)室），使用有代表性的微生物進(jìn)行挑戰(zhàn)，證明過(guò)濾器在生產(chǎn)條件下，可以*去除每個(gè)產(chǎn)品或產(chǎn)品家族中的微生物。應(yīng)建立針對(duì)每個(gè)產(chǎn)品組的科學(xué)解釋并可能需要在實(shí)施驗(yàn)證前經(jīng)合適的監(jiān)管機(jī)構(gòu)審查。細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)就可以*驗(yàn)證過(guò)濾濾芯的細(xì)菌截留性能，也可以充分反映整個(gè)工藝環(huán)節(jié)對(duì)濾芯過(guò)濾性能的影響。因此，在截留試驗(yàn)前必須做好如下準(zhǔn)備： 過(guò)濾工藝評(píng)估：通過(guò)驗(yàn)證服務(wù)調(diào)查問(wèn)卷，客戶溝通甚至現(xiàn)場(chǎng)拜訪，需要*了解客戶工藝流程，包括溶劑性質(zhì)（例如水基的、酸、堿、有機(jī)的）、過(guò)濾時(shí)間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過(guò)濾器設(shè)計(jì)規(guī)范，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)具體的情況，再結(jié)合過(guò)濾器本身的一些特性，模擬縮小化的工藝流程，這些流程需要與實(shí)際工藝流程相符或者更為惡劣，確保細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)*按照或者更高于實(shí)際工藝制定。 細(xì)菌培養(yǎng)和篩選：細(xì)菌截留試驗(yàn)采用缺陷假單胞菌（Brevundimonas diminuta, ATCC 19146），要求通過(guò)光學(xué)顯微鏡或者掃描電鏡觀察，直徑為0.3-0.4微米, 長(zhǎng)度為0.6-1.0微米，且呈單分散狀態(tài)，這些重要特性需每次進(jìn)行觀察和篩選，以免對(duì)截留試驗(yàn)造成影響。 膜片準(zhǔn)備：根據(jù)PDA 26號(hào)報(bào)告，至少應(yīng)該選擇3個(gè)批號(hào)濾膜，且需有一個(gè)批號(hào)的濾膜靠近該膜片的zui小臨界值。并且在進(jìn)行細(xì)菌挑戰(zhàn)前和后，這些膜片應(yīng)進(jìn)行完整性測(cè)試，數(shù)值需符合或超出濾芯廠家給出的判定值，zui終將結(jié)果記錄于報(bào)告中。表1是3M中國(guó)有限公司為某國(guó)內(nèi)藥廠做的驗(yàn)證服務(wù)記錄的相關(guān)數(shù)據(jù)，包含了細(xì)菌截留前和后的完整性數(shù)據(jù)，且都符合濾芯廠家給出的參考值。環(huán)境要求：為了消除周圍環(huán)境菌的影響，避免對(duì)后期的分析造成干擾，試驗(yàn)要求在專門的微生物潔凈室內(nèi)（class100000）進(jìn)行，具體的整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程需要在*中進(jìn)行，且整個(gè)潔凈間需要定期進(jìn)行消毒。 除菌過(guò)濾濾芯選擇 目前液體除菌濾芯主要有聚醚砜膜（PES）濾芯（圖2），尼龍膜（Nylon）濾芯（圖3），聚偏氟乙烯膜（PVDF）濾芯，聚四氟乙烯膜（PTFE）濾芯等。濾膜又分親水膜和疏水膜，對(duì)于部分有機(jī)相溶劑料液，需要根據(jù)實(shí)際要求采用疏水膜過(guò)濾濾芯。在除菌濾芯的選擇上，藥廠主要根據(jù)濾芯供應(yīng)商推薦或者依賴某個(gè)品牌。其實(shí)除菌濾芯選擇主要是由以下幾個(gè)因素決定的，這也再次論證了濾芯驗(yàn)證服務(wù)的重要性。 * 濾芯材質(zhì)（化學(xué)兼容性） * 細(xì)菌截留率 * 流速 * 使用壽命 * 熱穩(wěn)定性 * 化學(xué)穩(wěn)定性細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)介紹 根據(jù)ASTM838-83對(duì)除菌級(jí)濾芯的定義，用107 CFU/cm2 的缺陷性假單胞菌（ATCC 19146 ）進(jìn)行試驗(yàn)，下游濾出液無(wú)菌。細(xì)菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)研究的目的就是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得文件證據(jù)，證明在模擬工藝條件下，過(guò)濾過(guò)程可以持續(xù)去除懸浮于產(chǎn)品或替代流體中的高水平的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌或相關(guān)微生物污染分離物。 細(xì)菌截留試驗(yàn)進(jìn)行前，需要*行細(xì)菌存活性試驗(yàn)，來(lái)了解客戶產(chǎn)品在模擬的工藝條件下對(duì)截留菌生長(zhǎng)的影響，試想如果客戶產(chǎn)品在模擬工藝條件下，會(huì)對(duì)截留菌生長(zhǎng)造成影響，甚至無(wú)法存活，那分析濾膜未發(fā)現(xiàn)截留菌，是產(chǎn)品對(duì)截留菌的影響造成還是測(cè)試濾膜過(guò)濾的緣故都無(wú)從而知，因此細(xì)菌存活性試驗(yàn)是截留試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，可以為截留試驗(yàn)提供重要的理論依據(jù)，以此來(lái)確定截留試驗(yàn)的過(guò)程，是采用單步還是多步進(jìn)行試驗(yàn)。 細(xì)菌截留試驗(yàn)測(cè)試過(guò)程中使用如圖4所示裝置，一共包括CTL1-4四套截留裝置，CTL1-3即為所要驗(yàn)證濾芯的三個(gè)重復(fù)，CTL-4為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，其中TF1，2，3分別為不同批號(hào)的測(cè)試濾膜，為過(guò)濾精度為0.22微米或者0.2微米的除菌濾膜，且每個(gè)TF上下游都加裝壓力表，用于監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，測(cè)試濾膜兩端的壓力，TF4為對(duì)照，為過(guò)濾精度為0.45微米的濾膜，AF-1，2，3，4均為分析濾膜。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將產(chǎn)品或者替代液配置成一定濃度的挑戰(zhàn)液，一般要求不低于107 CFU/cm2，按照模擬的縮小化工藝條件，采用蠕動(dòng)泵將其按照一定的速度通過(guò)測(cè)試和分析濾膜，在試驗(yàn)過(guò)程中，需要在不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)壓力，流速，溫度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行監(jiān)控并記錄，且在細(xì)菌截留試驗(yàn)開始前和結(jié)束后，對(duì)微生物進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)確定挑戰(zhàn)菌的濃度。 當(dāng)截留試驗(yàn)結(jié)束后，需要將分析濾膜放于平板上培養(yǎng)，如果上游的測(cè)試濾膜為除菌濾膜，即圖中的TF1，2，3，則下游即分析濾膜上不會(huì)發(fā)現(xiàn)截留菌生長(zhǎng)，如果上游的測(cè)試濾膜為非除菌濾膜即TF-4，則下游即分析濾膜上會(huì)發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)菌生長(zhǎng)。根據(jù)分析濾膜上是否有挑戰(zhàn)菌生長(zhǎng)進(jìn)行判斷，對(duì)于對(duì)照CTL-4，因0.45微米濾膜對(duì)于挑戰(zhàn)菌濃度在104～106CFU/cm2時(shí)，無(wú)法達(dá)到除菌過(guò)濾的效果，所以對(duì)照組下游的分析濾膜，即AF-4必定會(huì)有挑戰(zhàn)菌的生長(zhǎng)，這樣一則可以對(duì)挑戰(zhàn)菌進(jìn)行鑒定，鑒定該挑戰(zhàn)菌的純度及形態(tài)特征，二則可以判斷挑戰(zhàn)液的濃度是否已經(jīng)達(dá)到預(yù)期的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括細(xì)菌截留前后膜片完整性測(cè)試值，陰性對(duì)照結(jié)果，產(chǎn)品循環(huán)工藝參數(shù)和分析膜片結(jié)果四個(gè)部分。如表1記錄了實(shí)驗(yàn)?zāi)て暾詼y(cè)試結(jié)果，從中可以對(duì)截留試驗(yàn)前和后，濾膜的完整性數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，是否符合濾芯廠家對(duì)于該類濾芯的完整性要求。表2陰性對(duì)照結(jié)果，需要確認(rèn)在未接種截留菌前整個(gè)截留裝置是否保持無(wú)菌。表三為分析濾膜結(jié)果，也是決定細(xì)菌截留試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵指標(biāo)，分為兩部分，*部分為截留菌的濃度，需按要求菌不低于107 CFU/cm2，可以分析達(dá)到了ASTM-838對(duì)除菌級(jí)濾芯截留濃度的要求，另外一部分為分析濾膜的結(jié)果，對(duì)于TCL-1，2，3裝置中AF均未發(fā)現(xiàn)截留菌，說(shuō)明TF可以恒定的去除挑戰(zhàn)液中的截留菌，對(duì)于對(duì)照組的TCL-4下游的AF4，則發(fā)現(xiàn)有截留菌生長(zhǎng)，可以利用特定的鑒定試劑盒，對(duì)結(jié)果進(jìn)行鑒定，確認(rèn)下游所發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌有且僅為我們的標(biāo)準(zhǔn)截留菌。結(jié)論 通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的闡述和分析，需要對(duì)此次細(xì)菌驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)。3M中國(guó)有限公司提供的細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)報(bào)告中會(huì)呈現(xiàn)三條總結(jié)，以下為某細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)報(bào)告總結(jié)。 1. 某公司使用3M除菌濾芯（如LifeASSURE? PDA PDA020F50JA）進(jìn)行某藥液的除菌過(guò)濾。試驗(yàn)在3M中國(guó)過(guò)濾驗(yàn)證服務(wù)中心進(jìn)行，本報(bào)告闡述了在模擬生產(chǎn)工藝條件下細(xì)菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果。 2. 當(dāng)缺陷性假單胞菌的挑戰(zhàn)濃度高于107 CFU/cm2時(shí)，所有測(cè)試膜片的濾出液全部無(wú)菌，測(cè)試結(jié)果符合判定標(biāo)準(zhǔn)。 3. 某公司在某藥液生產(chǎn)中使用LifeASSURE? PDA PDA020F50JA濾芯進(jìn)行除菌過(guò)濾，可以去除高水平負(fù)荷的缺陷性假單胞菌（ATCC19146）。(end) |
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