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  多酚氧化酶(P01yphenol Oxidase，PP0)是自然界分布極廣的一種氧化還原酶，茶葉中的多酚氧化酶通過控制不同的酶活可以加工成品質(zhì)與滋味迥異的各類茶葉。自1883年Yoghid發(fā)現(xiàn)日本漆樹液汁變硬可能和某種活性物質(zhì)相關(guān)，1938年KeilinD．和MannG研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和純化，得到多酚氧化酶并將這類酶稱為p01yphenol Oxidase。之后多酚氧化酶一直是研究的熱點(diǎn)，尤其是在PP0的生化、生理學(xué)性質(zhì)方面取得了較大的進(jìn)展。

　　1、 多酚氧化酶的分布與在植物中的作用

　　PP0是核編碼的的銅金屬酶，是在細(xì)胞質(zhì)中合成的，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中，PP0相當(dāng)穩(wěn)定，甚至在土壤中已腐爛的的植物殘?jiān)隙伎蓹z測(cè)到PP0的活性。在植物(如土豆、蘋果、荔枝、菠菜、馬鈴薯、豆類、茶葉、煙草等)組織中，PP0是與內(nèi)囊體膜結(jié)合在一起的，天然狀態(tài)無活性，但將組織勻漿或損傷后酶活被活化，從而表現(xiàn)出活性，在果蔬細(xì)胞組織中，PP0存在的位置因原料的種類、品種及成熟度的不同而有差異，綠葉中PP0活性大部分存在于葉綠體內(nèi)；馬鈴薯塊莖中幾乎所有的亞細(xì)胞部分都含有PP0，含量大約與蛋白質(zhì)部分相同，馬鈴薯芽、根的多酚氧化酶的活性zui高，幼葉和成熟塊莖中活性中等，成熟葉和莖葉活性zui低；在茶葉中的PPo可分為游離態(tài)和束縛態(tài)，前者主要存在于細(xì)胞液中屬可溶態(tài)PP0，而后者則主要存在于葉綠體、線粒體等細(xì)胞器中，與這些細(xì)胞器的膜系統(tǒng)或其他特異部位結(jié)合呈不溶態(tài)，StePhenThanarajS.N. (1990)研究了茶樹新稍中PP0活性及多酚含量對(duì)紅茶品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)PP0活性強(qiáng)，多酚含量高，對(duì)紅茶品質(zhì)有利，相反則利于綠茶的生產(chǎn)。在采摘的鮮蘋果中，PP0幾乎存在葉綠體和線粒體中，從這兩部分分別制備的PP0，其底物專一性稍有差異。劉乾剛認(rèn)為，PP0在細(xì)胞內(nèi)除了存在于葉綠體及線粒體上外，細(xì)胞壁也可能存在PP0，且對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響，細(xì)胞只要輕微破損便有PP0的作用。在動(dòng)物中(如鼠、免)，PP0也得到了分離。多酚氧化酶是一種質(zhì)體酶，有些研究人員認(rèn)為多酚氧化酶可能僅存在于質(zhì)體中，缺乏質(zhì)體的組織就不存在多酚氧化酶，例如篩管和篩胞等，但是有質(zhì)體的組織也可能沒有多酚氧化酶，如C4植物葉。含有質(zhì)體的植物組織不一定都存在多酚氧化酶，而多酚氧化酶一定在含有質(zhì)體的植物組織中。雖然從1895年就開始了多酚氧化酶的研究報(bào)道，但其在植物組織中的功能并未充分了解，隨分子生物學(xué)的發(fā)展，象西紅柿、蘋果等的多酚氧化酶的基因已被克隆。浙江大學(xué)趙東等對(duì)茶樹多酚氧化酶的克隆及其序列進(jìn)行了比較。從已經(jīng)克隆的多酚氧化酶的基因看，均屬于基因家族，多則6—7個(gè)基因。這些基因的表達(dá)具有時(shí)空差異和組織特異性(PP0在幼齡組織中表達(dá)，在成熟組織中不表達(dá))，表明了植物中所起的作用不同。但在高等植物組織發(fā)生褐變主要是PP0活動(dòng)的結(jié)果。

　　2、果實(shí)中多酚氧化酶的作用條件

　　果實(shí)在樹上生長(zhǎng)時(shí)不會(huì)發(fā)生褐變，褐變發(fā)生在果實(shí)采后貯藏過程中，而且隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)褐變加重，說明褐變與果實(shí)成熟衰老有關(guān)。采收期的早晚對(duì)酶促褐變的影響可能是組織衰老和自身保護(hù)酶系。 不同產(chǎn)地果實(shí)的褐變程度也不同，說明褐變與果樹的栽培管理和果實(shí)的營養(yǎng)水平有一定關(guān)系。不同大小的果實(shí)在儲(chǔ)藏過程中的褐變程度不同，一般大果實(shí)比小果實(shí)易發(fā)生褐變，原因可能與果實(shí)儲(chǔ)藏后期果心釋放出來的CO2不能及時(shí)排出有關(guān)。

　　統(tǒng)互相作用的結(jié)果。

　　3、果實(shí)中與褐變有關(guān)的酶及特點(diǎn)

　　國內(nèi)外的研究一致認(rèn)為果實(shí)中的PPO是果實(shí)發(fā)生酶促褐變的主要酶。PPO是一種含銅酶，能催化兩類不同的反應(yīng)，可以使一元酚羥基化，生成相應(yīng)的鄰二經(jīng)基化合物；也可以氧化鄰苯二酚生成醌。對(duì)PPO進(jìn)行分離純化鑒定，認(rèn)為PPO有幾種不同的存在形式，zui重要的是相對(duì)分子質(zhì)量為64000的一種。PPO與果實(shí)褐變有密切的關(guān)系，在蘋果開花后的4—5個(gè)月內(nèi)，蛋白質(zhì)中PPO的含量保持不變，但PPO的活性降低了，在末成熟的果實(shí)中，有活性的PPO大多存在于果心部位，果心處的PPO活性zui高，其次是果肉，zui后是果皮，這與果實(shí)從果心向果皮的褐變過程吻合。對(duì)PPO的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PPO有同工酶存在，依據(jù)是在不同PH系列下PPO的活性出現(xiàn)兩個(gè)以上的峰。對(duì)分離的PPO同工酶性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)同工酶間的性質(zhì)差別較大。關(guān)于PPO活性zui適宜的PH，研究結(jié)果存在爭(zhēng)議，有人認(rèn)為pH 3.8zui適宜，也有人認(rèn)為pH 6.2：或pH5.6zui適宜。對(duì)PPO熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果比較一致，在60℃以上仍有部分活性。根據(jù)這一特性，陳秀芳等認(rèn)為桃加工后期發(fā)生的褐變，不*是非酶褐變,也可能有酶促褐變的參與。

　　3、 果實(shí)中PPO的底物

　　PPO的底物是酚類物質(zhì)，果實(shí)中的酚類物質(zhì)很多，酚類物質(zhì)的種類和含量在果實(shí)生長(zhǎng)和成熟過程中會(huì)發(fā)生變化，在果實(shí)貯藏過程中隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)含量下降，同時(shí)隨果實(shí)酚類物質(zhì)含量的下降，PPO活性增加，褐變?cè)黾印Ｒ话阏J(rèn)為果實(shí)在儲(chǔ)藏期間酚類物質(zhì)含量的下降是被PPO氧化的結(jié)果。PPO對(duì)鄰經(jīng)基結(jié)構(gòu)作用zui強(qiáng)，同時(shí)取代基團(tuán)的取代位置也影響酶與底物的結(jié)合能力。總之，不同種類的果實(shí)PPO的底物可能

　　不同，同一類果實(shí)在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段，PPO底物也可能不同。研究PPO主要底物應(yīng)以該底物含量在褐變前后發(fā)生變化的程度為主要依據(jù)。

　　4、褐變與果實(shí)成熟衰老的關(guān)系

　　隨著果實(shí)貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)內(nèi)部發(fā)生了一系列的生理生化變化，表現(xiàn)為果膠物質(zhì)的分解，有機(jī)酸的下降，呼吸增加，乙烯釋放增加，總的趨勢(shì)是趨于衰老。果實(shí)在貯藏過程中發(fā)生酶促褐變的根本原因與果實(shí)衰老有關(guān)，吳民江等對(duì)蘋果梨

　　貯藏過程中果皮褐變進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在貯藏過程中果皮酚類物質(zhì)含量降低，褐變加深，他們認(rèn)為，果皮失水及膜脂氧化作用導(dǎo)致組織膜透性增大、區(qū)域比分布破壞是褐變反應(yīng)的重要原因。

　　一般認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)酶與底物是分區(qū)定位的，正常的生活細(xì)胞具有完整的超微結(jié)構(gòu)，能保證各種生理生化反應(yīng)正常進(jìn)行。酚類物質(zhì)主要存在于液泡中，PPO主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常時(shí)二者不能互相接觸，不會(huì)發(fā)生酶促褐變；當(dāng)組織衰老時(shí)，由于膜系統(tǒng)的破壞導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞空間區(qū)劃喪失，使原來酶與底物的分區(qū)定位遭到破壞，從而酶與底物接觸，誘發(fā)了酶促褐變。

　　5、 多酚氧化酶的提取方法及活性測(cè)定

　　多酚氧化酶是一種重要的末端氧化酶，不管是對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)、同工酶、活性以及影響因子的研究，還是對(duì)生理功能、基因克隆等方面的研究，都需要把多酚氧化酶從物體中分離純化出來。1911—1912年間Bemald和Welter沿用Marn的酶提取方法(鮮葉加獸皮粉搗碎，再以酒精沉淀，zui后得到的白色干燥粉，即為酶制劑)，早期分離得到的酶大多數(shù)是不溶性，活力很低。后來學(xué)者在提取介質(zhì)中加人多酚吸附劑，才分離出可溶的多酚氧化酶，即將Polycar—AT(PVP)用于茶葉酶學(xué)研究，并指出多酚吸附劑，如PVP的使用對(duì)任何富含多酚的植物酶學(xué)都是有必要的。C08Ron等(1993)采用液氮低溫冷凍提取介質(zhì)的PH＝7.0，加人吐溫—80或葡聚糖凝膠G—50，該改良方法可獲得活力較高的可溶性多酚氧化酶。在蘋果研究中，發(fā)現(xiàn)品種不同，酶活亦不同，為了有效的控制酶促褐變，有學(xué)者利用乳化劑(Triton X100)和酚結(jié)合劑—聚乙烯毗咯烷酮(PVPP)相結(jié)合的方式提取PP0酶，從而解決了單純用丙酮粉法預(yù)處理而導(dǎo)致的酶特性的改變。在一般材料中的PP0酶的研究多采用丙酮粉法和緩沖液勻漿法。如有的學(xué)者進(jìn)行小麥活性檢測(cè)采用的是緩沖液勻漿法，而在棗果實(shí)多酚氧化酶性質(zhì)的研究中有的學(xué)者，則采用的是丙酮粉法。

　　綜上所述，多酚氧化酶一般采用如下幾種提取方法：(1)、丙酮粉法(常規(guī)法)；（2）、勻漿法；（3）、勻漿浸提法。在這些方法中，有實(shí)驗(yàn)者表明丙酮粉法對(duì)PP0酶提取活性損失較大，活性得率較低，但其酶粉活性尚可、體積小和便于貯存，可直接應(yīng)用；緩沖液勻漿液提取活性得率較高，但酶液本身活性較高，不利于酶的應(yīng)用，尚需進(jìn)行濃縮、提純才能達(dá)到應(yīng)用的要求。另據(jù)報(bào)道采用勻漿法和丙酮粉法二者結(jié)合的方法，是一種很好的提酶方法。

　　多酚氧化酶活性的測(cè)定方法一般是：（1）、檢壓法就是在一定的溫度、PH值和基質(zhì)濃度下，多酚氧化酶氧化基質(zhì)的速率與單位酶濃度和單位時(shí)間內(nèi)的耗氧量成正比。因此用瓦氏呼吸計(jì)測(cè)定耗氧率知多酚氧化酶活性的高低。（2）、氧電極法主要是利用氧電極測(cè)定反應(yīng)中的耗氧量來表示酶活力，例如可以用來測(cè)小麥的酶活。（3）、比色法主要是多酚氧化酶催化鄰苯二酚氧化生成有色產(chǎn)物，單位時(shí)間內(nèi)有色產(chǎn)物在460nm處的光密度與酶活性強(qiáng)弱成正比。（4）、碘量滴定法。其中比色法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果較準(zhǔn)確，目前zui常用。

　　6、 多酚氧化酶貯藏過程中的酶活變化

　　多酚氧化酶在氧氣存在的條件下，催化各種酚類(單寧、兒茶酸、黃酮、一元酚等)使之氧化成酮，再進(jìn)一步氧化聚合成黑色素。近幾十年來，國內(nèi)外對(duì)植物組織的褐變進(jìn)行研究的結(jié)果一致表明，組織的褐變現(xiàn)象主要是多酚氧化酶作用于天然底物酚類物質(zhì)所致。不少學(xué)者對(duì)果蔬加工和貯藏進(jìn)行多酚氧化酶的活性變化研究。因?yàn)楣咴诓烧笕匀贿M(jìn)行著一系列的生化反應(yīng)，果蔬中貯存的物質(zhì)逐漸被水解，并以酶系的催化反應(yīng)為主要特征，從而會(huì)出現(xiàn)色變，影響品質(zhì)。有的學(xué)者研究了蘋果材料在不同貯藏期后，PP0活性隨貯期延長(zhǎng)而下降，PP0在果實(shí)采收時(shí)保持有較高活性，而隨著貯期延長(zhǎng)，果實(shí)中的生化反應(yīng)加強(qiáng)，從而活性發(fā)生了變化。關(guān)于棗果實(shí)采后貯存中PP0的活性變化，冠小紅(2000)認(rèn)為呈上升趨勢(shì)。但關(guān)于丙酮粉提取的多酚氧化酶活性變化到目前為止末見到相關(guān)的報(bào)道。多酚氧化酶活性對(duì)茶葉的品質(zhì)影響較大，并且不同類型的茶葉要求不同活性的多酚氧化酶，紅茶中要求較高的酶活，使多酚氧化酶氧化生成紅茶中*的色澤和香味。而綠茶則要求較低的酶活性，減少多酚類的氧化，以保持茶葉的綠色和鮮爽的特點(diǎn)。一些學(xué)者對(duì)于茶葉中多酚氧化酶活性變化主要著重緩沖液浸提與否，何種提取方法(因?yàn)閷?duì)于酶活的高低，受到提取方法等外在條件的影響)和萎凋輕重問題等。在1998年劉仲華研究表明，用丙酮粉提取的酶浸提與不浸提相比，酶活有很大的不同，浸提12h，酶活力幾乎高一倍。但對(duì)于茶鮮葉和丙酮粉提取貯藏中活性變化未見到相關(guān)報(bào)道。

　　7、 多酚氧化酶的同工酶

　　同工酶在植物體內(nèi)廣泛存在，植物中研究較多的同工酶有過氧化物酶(POP)，多酚氧化酶(PP0)的同工酶。茶PP0同工酶的研究zui早是60年代初，1963—1966年，Bendall和Gregorg分離了5種同工酶，1971年P(guān)ruidze等人分離出6種同工酶，1974年Buz抓等人測(cè)定了這6種同工酶的分子量，近年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PP0的酶譜中，多的可達(dá)10條。酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，而同工酶是其有相同功能而結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的酶分子，它的合成主要受遺傳基因的控制，具有一定的穩(wěn)定性。PP0同工酶的分離一般采用聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(垂直平板電泳)和圓盤電泳。同工酶分析已廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源、遺傳育種、生理代謝、個(gè)體發(fā)育及適應(yīng)不良環(huán)境變化等研究領(lǐng)域。近年來，有關(guān)農(nóng)作物、果樹及其它木本植物POD和PP0的同工酶研究已有不少報(bào)道，POD和PP0是同工酶分析中常用的酶，它們與植物生長(zhǎng)發(fā)育過程密切相關(guān)，因此可反映出植物體生長(zhǎng)發(fā)育過程中基因的存在和表達(dá)情況，且POD和PP0能將植物體內(nèi)某些有害的代謝副產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害物質(zhì)，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和提高抗性起積極作用。同工酶技術(shù)是研究物種分類以及確定物種親緣的一種重要而有效的手段，國內(nèi)外學(xué)者利用同工酶技術(shù)對(duì)茶葉加工過程中的生化成分變化，品種間親緣關(guān)系分析等方面都做了大量工作，現(xiàn)在我國科研人員還通過研究同工酶，探討茶樹的起源，品種的早期鑒定，加工中同工酶的變化對(duì)品質(zhì)的影響等問題。

　　8、 影響酶活的因素

　　主要有pH、作用溫度、底物濃度、酶液自身的濃度以及作用時(shí)間。由于食品種類的不同，各種因素的影響也有較大差異。

　　9、多酚氧化酶的應(yīng)用

　　PP0與抗病性的關(guān)系人們已進(jìn)行了廣泛的研究。植物在抵御病原微生物的侵染過程中，抗性相關(guān)酶發(fā)揮了重要作用，這主要包括了酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白家族PP0通過催化木質(zhì)素及酮類化合物形成，構(gòu)成保護(hù)性屏蔽而使細(xì)胞免受病菌的侵害，也可以通過形成酮類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。

　　目前，有關(guān)抗性相關(guān)酶在植物感病的過程中的變化情況已有大量報(bào)道，如利用番茄、黃瓜等植株作為試材，考察相關(guān)病后菌侵染對(duì)PP0、POD和pAL高抗性相關(guān)酶的活性都會(huì)提高，這3種酶與植物抗性的獲得呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。PP0催化酚類化合物形成的酮類化合物具有更大的毒性，有關(guān)多酚氧化酶及其同工酶與植物抗病蟲等抗性關(guān)系的研究已有報(bào)道。PP0是黑色素生物合成過程中的主要限速酶。大多數(shù)皮膚病脫色劑都是通過抑制該酶活性來阻斷皮膚黑色素生成。從植物藥中分離天然的活性成分日益受到人們的關(guān)注，不但在臨床用于黃褐斑、雀斑等色素增加性皮膚病的治療，而且還作為用于美容化妝品。污水中酚的檢測(cè)，由于方法，儀器昂貴等方面的原因，不便現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，有的學(xué)者通過研究生物傳感器—PP0傳感器測(cè)定酚類化合物，簡(jiǎn)單，且有一定的靈敏度和準(zhǔn)確度。在昆蟲體內(nèi)，PP0參與外甲的硬化及起自身的保護(hù)作用。

　　多酚氧化酶的作用主要是促使兒茶素類物質(zhì)氧化形成茶黃素、茶紅素和其它的氧化聚合物，同時(shí)伴隨兒茶素的氧化，氨基酸、胡蘿F素等香氣前體發(fā)生偶聯(lián)氧化，產(chǎn)生各種各樣的香氣化合物，并形成紅茶的基本風(fēng)味(滋味、香氣)。而茶色素是一類茶多酚氧化的產(chǎn)物，具有生理活性。目前茶色素在臨床上已經(jīng)用于防治心臟病、高血脂、高血壓等心血管疾病，另外還用于抗癌、抗突變、抗菌、抗病毒等功效。

　　10、問題與展望

　　關(guān)于果實(shí)酶促褐變方面的研究很多，褐變機(jī)理也比較復(fù)雜，目前尚未*弄清。關(guān)鍵問題集中在對(duì)PPO及其底物的研究以及采后貯藏環(huán)境對(duì)酶促褐變的影響。有關(guān)果實(shí)貯藏前的營養(yǎng)狀況(主要決定于果樹栽培的外界氣候及土壤條件)與酶促褐變的關(guān)系研究較少。酶促褐變與果實(shí)衰老有密切關(guān)系，衰老過程中酶與底物的分區(qū)定位遭

　　到破壞是導(dǎo)致酶促褐變的主要原因。PPO合成基因的表達(dá)可能與衰老有關(guān)。對(duì)PPO的深入研究有望從分子水平上搞清酶促褐變的機(jī)理，為控制酶促褐變提供新方法。

　　同時(shí)，改變PPO基因的表達(dá)，減少面制食品的酶促褐變，也是小麥品質(zhì)育種的目標(biāo)之一。若用常規(guī)育種方法降低PPO活性，很難成功。小麥PPO保守區(qū)cDNA的成功克隆，可以用來構(gòu)建反義基因表達(dá)載體，利用反義RNA技術(shù)反向表達(dá)PPO基因，修飾轉(zhuǎn)基因植株中多酚氧化酶基因的表達(dá)，從而控制酶促褐變。目前已成功利用該技術(shù)得到了無褐變的馬鈴薯品系。除了對(duì)蘋果、梨、茶葉、小麥等作物的報(bào)道外，而且對(duì)于其它食品中的多酚氧化酶的研究也日漸豐富起來，例如：對(duì)于煙草、棗果實(shí)、蕨菜、茄子、蓮藕、香蕉、蕃茄