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試劑及材料:
1)PBS
2)0.8%正常熔點(diǎn)凝膠(PBS配制)
3)0.6%低熔點(diǎn)凝膠(PBS配制)
4)毛玻璃片
5)蓋玻片
6)堿性裂解液(2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸鈉),臨用前加10%DNMSO,1%Triton X-100
7)電泳緩沖液(1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH;Tris.Cl,pH7.5)
8)EB(2ug/ml)
步驟:
1.制備*層膠:100ml 0.8%正常熔點(diǎn)膠,加蓋蓋玻片,4℃固化10min;
2.制備第二層膠:輕輕地去除蓋玻片,在*層膠上滴加75ul含1×10000個(gè)細(xì)胞的0.6%低熔點(diǎn)膠(cell與凝膠比例為1:5),加蓋蓋玻片,4℃固化10min;
3.裂解:去掉蓋玻片,將凝膠浸入冰冷的堿性裂解液內(nèi)(臨用前加10% DMAO,1%Triton X-100),4℃裂解1h;
4.取出玻片,用PBS緩沖液漂洗3次后置于水平電泳槽內(nèi),加入pH13的電泳緩沖液(沒過玻片2-3min),放置20min(黑閉)。
5.電泳:電壓20V,300mA,30min
6.取出玻片,用PBS或Tris.Cl,pH7.5漂洗3次,每次3min;
7.染色:膠上滴加3ulEB,加蓋蓋玻片,24h檢測(cè)?;蛘?℃,潮濕,閉光的條件下保有膠片,觀察時(shí)再染色,鏡檢。
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