預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中腫瘤特異生長因子（TSGF）含量。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中TSGF水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入TSGF、生物素化的抗人TSGF抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TSGF呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1.酶聯(lián)板:一塊（96孔）
2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）:2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為10000pg/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋成為10000pg/ml,5000pg/ml,2500pg/ml,1250pg/ml,625pg/ml,312pg/ml,156pg/ml,其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度100pg/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。
如配制5000pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml,10000pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。
3.樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
5.檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
6.檢測溶液A:1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制
（每孔100ul）,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。
7.檢測溶液B:1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.底物溶液:1×10ml/瓶。
9.濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.終止液:1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
標(biāo)本的采集及保存
1細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請離心后收集上清,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.血清:標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000xg離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.血漿;可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8℃ 1000xg離心15分鐘,或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注;標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻,酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。
2.棄去液體，甩干，不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液A工作液 100ul,37℃,60分鐘。洗板次,350ul/每孔,甩干。
4.每孔加檢測溶液B工作液100ul,37℃,60分鐘,洗板5次,甩干。
5.依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯）。
6.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。
注：
1.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
2.為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人TSGF,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
注意事項
1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
3.請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。
4.如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6.底物請避光保存。
檢測范圍:156pg/ml-10000pg/ml
說明
1.試劑盒保存:-20℃（較長時間不用時）;2-8℃（頻繁使用時）。
2.有效期:6個月
3.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
4.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
5.中、英文說明書可能會有不*之處,請以英文說明書為準(zhǔn)。