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胰酶分離提取
點(diǎn)擊次數(shù)：675 發(fā)布時(shí)間：2010-5-24
一、原理與目的
提取制備酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級(jí)沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，zui后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結(jié)晶。
胰酶在PH3.0時(shí)zui穩(wěn)定，可在低溫下儲(chǔ)存較長的時(shí)間而不失活；低與此PH酶易變性；高于PH5時(shí)，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程應(yīng)在低溫和低PH下進(jìn)行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動(dòng)物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理?xiàng)l件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環(huán)化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約24000－25000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過程中，酶原N端Lys與Ile之間的 一個(gè)肽鏈被斷裂，丟失一個(gè)6肽，分子構(gòu)象發(fā)生改變，PI變成10.8。
本實(shí)驗(yàn)擬通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時(shí)為親和層析、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣品。
二、材料與試劑
1．儀器
紫外光分光光度計(jì)、恒溫水浴、離心機(jī)、組織搗碎機(jī)、PH計(jì)、顯微鏡、秒表、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。
2．材料：新鮮豬胰臟
3．試劑及溶液配制
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時(shí)稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。
0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合后用PH計(jì)校正。
三、操作步驟
1．胰蛋白酶原的提取與分離：
（1）稱取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，在低溫下用絞肉機(jī)絞碎胰臟（或用高速組織勻漿機(jī)搗碎）加1－2倍體積以預(yù)冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提?。ò?g組織相當(dāng)于1ml體積計(jì)算，以此類推）。檢查提取液中PH，若高于PH3.0時(shí)應(yīng)及時(shí)用10％乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而后用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘?jiān)淮危〞r(shí)間約為1－2h），合并濾液，此時(shí)濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調(diào)整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進(jìn)行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。
（2）鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進(jìn)行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用4000r/min離心機(jī)離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱重，可得約20g胰蛋白酶原粗制品。
（3）胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用于測(cè)定，溶液中硫酸銨得含量（約為濾餅重得1/4）。因?yàn)榱蛩徜@可以與活化劑鈣離子結(jié)合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會(huì)直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計(jì)算，將已研細(xì)的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調(diào)PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結(jié)晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。
（4）純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約1000ml，加入已經(jīng)研細(xì)的硫酸銨粉末，使其溶液達(dá)40％飽和度（每升濾液加242g硫酸銨）。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉淀。