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BCA蛋白定量試劑盒使用說明書 

【產(chǎn)品組成】

Component	SBJ-1001S 250T	SBJ-1001M 500T	Store at
試劑(A):BCA試劑A	50ml	100ml	室溫,避光
試劑(B):BCA試劑B	1.5ml	3ml	室溫
試劑(C):蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)	20mg	20mg	室溫
試劑(D):蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液	5ml	10ml	室溫

【保存條件】

室溫,避光,6個(gè)月

【產(chǎn)品概述】

  目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和Bradford蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit)。BCA法與傳統(tǒng)方法相比，更簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。BCA法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響，對于5%以內(nèi)的SDS、TritonX-100、Tween20、Tween80具有很好的兼容性,但BCA法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度的還原劑等的影響，在BCA法測定蛋白濃度前應(yīng)盡量使：EDTA濃度≤m10M，DTT濃度≤1mM，2-ME≤0.01%。

  BCA Protein Assay Kit在50～1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，其小檢出量為25μg/ml。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

【使用方法】

1、取1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液*加入到含有20mg的蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)中，充分溶解，后配制成20mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制后可立即使用，配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃保存。

2、取適量的20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至終濃度為500μg/ml或所需濃度。如取25μl20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入975μl稀釋液，充分混勻，即配制成500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。特別提示：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，例如待測蛋白溶解于蔗糖中，亦取20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶解于蔗糖中。一般也可以用0.9%NaCl或PBS作為溶解BSA稀釋液，稀釋后的500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液也應(yīng)-20℃長期保存。

3、根據(jù)樣品數(shù)量，按試劑(A):試劑(B)=50:1的比例配制BCA工作液，即取50份BCA試劑A和1份BCA試劑B，充分混勻，即獲得BCA工作液。例如取5mlBCA試劑A和0.1ml BCA試劑B，配制成5.1ml BCA工作液，BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

4、將500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板或EP管中，加稀釋液補(bǔ)足至20μl，其蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml。

5、加20μl待測蛋白到96孔板或EP管中，如果樣本不足20μl，用稀釋液補(bǔ)足至20μl。注意：如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應(yīng)在待測蛋白中加入20μl稀釋液；如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白樣本的溶液相同，無需在待測蛋室溫白樣本孔中加入20μl稀釋液，以減少不同溶液的差異。

6、各孔或管加入200μl配制好的BCA工作液，37℃孵育20～30min。

7、酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測定562nm波長處吸光度(如無562nm，540～595nm之間的波長也可)，各孔或管吸光度減去用未加500μg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以求得的差值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)孔或管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品的蛋白濃度。

【注意事項(xiàng)】

 

1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)粉末溶解于蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液后，即獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測，該蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液-20℃長期保存。

2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確。

3、如果檢測效果不佳，可以室溫放置2h或60℃放置30min，顏色會隨著時(shí)間的延長不斷加深。顯色反應(yīng)也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低，可以適當(dāng)延長孵育時(shí)間或在較高溫度下孵育。

4、測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化，可能的原因是樣品中含有嚴(yán)重干擾BCA法測定蛋白濃度的物質(zhì)。

5、BCA法檢測中樣本中不應(yīng)含有EGTA，否則影響檢測結(jié)果。

6、因BCA法測定時(shí)顏色會隨著時(shí)間的延長不斷加深，建議每次測定時(shí)都做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，否則每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7、如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通分光光度計(jì)測定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的小檢測體積。應(yīng)按比例適當(dāng)加大BCA工作液的用量使總體積不小于小檢測體積，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量亦相應(yīng)按比例放大；使用分光光度計(jì)測定蛋白濃度時(shí)，可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少。

8、為了加快BCA法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過熱，否則易失效。