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三磷酸腺苷的發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程及操作步驟-核酸類(lèi)藥物發(fā)酵技術(shù)

、三磷酸腺苷的概述

1.三舜酸腺并的結(jié)構(gòu)

三磷酸腺苷（ATP）是由1個(gè)腺嘌呤、1個(gè)核糖和3個(gè)磷酸單位組成的核苷酸，結(jié)構(gòu)式如下：H，N O OHOH

2.三磷酸踩苷的理化性質(zhì)

藥用ATP是其二鈉鹽（ATP-Na?），又名腺苷三磷酸二鈉，帶3個(gè)結(jié)晶水（ATP-Na；·3H:O），呈白色結(jié)晶形及類(lèi)白色粉末；無(wú)臭，微有酸味，有吸濕性；易溶于水，難溶于乙醇、、苯、，在堿性溶液（pH10）中較穩(wěn)定。ATP-Na?為兩性化合物。

3.三磷酸腺并的生理功能

三磷酸腺苷是體內(nèi)組織細(xì)胞切生命活動(dòng)所需能量的直接來(lái)源，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)能的“分子貨幣"，儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能，蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸的合成都需要它參與，可促使機(jī)體各種細(xì)胞的修復(fù)和再生，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性，對(duì)治療各種疾病均有較強(qiáng)的針對(duì)性。

二、三磷酸腺苷的生產(chǎn)方法

ATP是重要的醫(yī)藥品，其生產(chǎn)方法可以腺嘌呤為前體用發(fā)酵法直接生產(chǎn)，也可以AMP為原料，經(jīng)過(guò)磷酸化作用生成ATP。AMP可以腺嘌呤為前體發(fā)酵生產(chǎn)，也可先發(fā)酵生產(chǎn)腺苷，再經(jīng)微生物磷酸化或化學(xué)方法磷酸化而創(chuàng)得。

1.AMP的生產(chǎn)

1）以腺嘌呤為前體發(fā)酵生產(chǎn)AMP產(chǎn)氨短桿菌ATCC6872等菌株可由嘌呤堿基生成相應(yīng)的嘌呤核苷酸。例如由腺票呤生成AMP、ADP和ATP.在該發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)氨短桿菌補(bǔ)效途徑活性強(qiáng)和磷酸酯酶活性弱的特點(diǎn)有利于核苷酸的生成和積累。

2）以腺嘌呤為前體發(fā)酵生產(chǎn)腺苷

1962年，Nara等把枯草芽孢桿茵160（Sm2+try）菌株經(jīng)再次誘變得到的嘌呤缺陷型（Sm'+try+pur）菌株，在添加由丙二胺化學(xué)合成的腺嘌呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而累積大量的脹苷。培養(yǎng)基的碳源以葡萄糖為佳，若添加少量核糖可增加腺苷的產(chǎn)量。氮源以蛋白胨、肉膏、酪朊氨基酸為佳。添加能提高腺甘產(chǎn)量，培養(yǎng)基中添加1~2

mg/ml的腺嘌呤，培養(yǎng)40h，可積累1mg/mL腺苷。

3）直接發(fā)酵生產(chǎn)腺苷

生產(chǎn)原苷的出發(fā)菌株般選用具有強(qiáng)烈的降解核苷酸酶系的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌。理想菌種的特性如下：

①喪失IMP脫氛酶，即缺陷型。為了防止回復(fù)突變，將其進(jìn)步再誘變成喪失XMP的氯化酶，即增加缺陷型的遺傳標(biāo)記是有效的。

②需要切斷從AMP到IMP的通路，喪失AMP脫氨酶或該酶活性微弱。

③為了積累腺苷，凡屬腺苷分解酶的核苷酶或核苷磷酸化酶的活性必須微弱。

④必須解除AMP類(lèi)物質(zhì)終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)?？蛇x育抗代謝類(lèi)似物突變株，如8AG、8AX等，綜上所述，枯草芽孢桿菌作為腺苷產(chǎn)生菌的遺傳標(biāo)記應(yīng)具備：Xan+Gu+dea +8AG+Np。

2.微生物磷酸化

通過(guò)磷酸化作用可將、腺苷、鳥(niǎo)甘等核苷分別轉(zhuǎn)變成IMP、AMP、GMP等，并將AMP轉(zhuǎn)變?yōu)锳DP、ATP，將GMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP、GTP。

面包酵母和清酒酵母的酶制劑可使AMP磷酸化為ADP和ATP，并伴隨有葡萄糖的降解。

使用磨碎的面包酵母或丙砌干燥的面包酵母菌體，在葡萄糖發(fā)酵條件下添加AMP或腺苷，進(jìn)行氧化磷酸化。所加入的AMP或腺苷被高效地磷酸化為ATP和ADP。反應(yīng)3h，可將約72%的AMP磷酸化為ATP。作為酶原，若使用風(fēng)于菌體或活菌體，AMP的磷酸化幾乎不能進(jìn)行。自腺苷磷酸化生成ATP，只能使用丙酮干燥菌體。該方法的關(guān)鍵在于反應(yīng)液中磷酸鹽緩沖液的濃度。即在使用丙酮干燥菌體的場(chǎng)合下，磷酸鹽緩沖液濃度為1/3mol/L時(shí)才能引起AMP的磷酸化；當(dāng)磷酸鹽緩沖液的濃度為1/9mol/L或2/3mol/L時(shí)，磷酸化反應(yīng)不能發(fā)生。使用研碎菌體時(shí)，磷酸化的適磷酸鹽沖液濃度為1/4mol/L。關(guān)于ATP的生成機(jī)制，可以認(rèn)為是利用葡萄糖分解時(shí)獲得的能量，通過(guò)底物水平磷酸化，由AMP或腺苷經(jīng)ADP生成ATP。就發(fā)酵條件而言，以高濃度Pi抑制磷酸酯酶的作用和用AMP解除高磷酸鹽濃度時(shí)的發(fā)酵障得是此方法的本質(zhì)。

3.發(fā)酵法生產(chǎn)ATP

根據(jù)以腺嘌呤為前體發(fā)酵生產(chǎn)AMP的初步研究結(jié)果，進(jìn)步改良發(fā)酵工藝，則有可能大生產(chǎn)ATP。

產(chǎn)氨短桿菌B1-787經(jīng)菌種培養(yǎng)后移入發(fā)酵罐培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、溫度、pH、通氣及攪拌條件下培養(yǎng)40h，后加入前體物質(zhì)腺嘌呤及表面活性劑和尿素，控制條件繼續(xù)培養(yǎng)，使發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)醉液中含有較多的ATP。

發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，過(guò)濾得到濾液，經(jīng)活性炭柱吸附和氨醇溶液洗脫，獲得ATP溶液。ATP的磷酸基在堿性氨醇中解離成陰離子，經(jīng)陰離子交換柱吸附，用定離子強(qiáng)度的溶劑洗脫，收集得到ATP粗品，用結(jié)晶法獲得ATP精品。

上述發(fā)酵方法以采用高濃度磷酸鹽為特征，添加表面活性劑可以提高ATP產(chǎn)量。

此外，加入氨基酸、維生素等可促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)，防止發(fā)酵過(guò)程中回復(fù)突變的發(fā)生，有利于穩(wěn)定發(fā)醉，提高ATP產(chǎn)量。

三、菌種培養(yǎng)

培養(yǎng)基成分：葡萄糖10%，MgSO，·7H?01%，尿素0.3%，CaCl?·2H2O0.01%，玉米漿適量，1%，磷酸二氫鉀1%，pH為7.2.

各種子培養(yǎng)時(shí)間為0~24h，接種量為7%~9%，pH控制在6.8~7.2。

四、發(fā)酵培養(yǎng)

將菌種接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)28~30℃，24h前通氣量為0.5：1，24h后通氣量為1.0：1，40h后投入腺嘌呤0.2%，6501（椰子油酰胺）0.15%，尿素0.3%，升溫至37C，pH為7.0.

五、提取及精制

發(fā)酵液加熱使酶失活后，調(diào)節(jié)pH至3~3.5；過(guò)濾除去菌體，濾液通過(guò)769型活性炭柱，用氨醇溶液洗脫，洗脫液再經(jīng)Cl-型陰離子柱，經(jīng)氯化鈉-鹽酸溶液洗脫，洗脫液用結(jié)晶法制得ATP精品。

考思考題

1.核酸類(lèi)藥物主要有哪些臨床應(yīng)用？舉例說(shuō)明。

2.有何性質(zhì)？目前發(fā)酵法生產(chǎn)主要有哪幾種途徑？

3.簡(jiǎn)述發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程。

4.ATP的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)是怎樣的？

5.簡(jiǎn)述ATP發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程。