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菌種的來源

微生物是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵，因此，工業(yè)生產(chǎn)用菌種應(yīng)該滿足以下要求：遺傳性穩(wěn)定，可長期保存；對誘變劑敏感；容易產(chǎn)生營養(yǎng)細(xì)胞、孢子或其他繁殖體，種子培養(yǎng)時生長旺盛，快速繁殖；能抵抗噬菌體的污染；發(fā)酵周期短，毒、副產(chǎn)物少；下游工程易于操作。

具有上述特征的微生物可從自然界中篩選，也可以從有關(guān)科研單位或工廠索取。自然界篩選菌種的樣品來源主要包括土壤、水、動植物、新鮮或腐爛的食物、昆蟲的排泄物等。

、菌種類型

工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中常用的微生物主要是細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類。

1.常見的細(xì)菌

（1）大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）大腸埃希氏桿菌簡稱大腸桿菌，是為的原核微生物。革蘭氏染色陰性，短桿狀，大小為（0.5-1.0）um×3.0um；運動或者不運動，運動者周生鞭毛。多數(shù)大腸桿菌對人體無害，是常見條件致病菌。大腸桿菌生長迅速，營養(yǎng)要求低，是早用作基因工程的宿主菌。工業(yè)上常將大腸桿菌用于生產(chǎn)脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、及等。此外，些基因工程表達產(chǎn)物，如干擾素、人胰島素、人生長激素等，已實現(xiàn)大腸桿菌的高密度發(fā)酵生產(chǎn)。

（2）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）

枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬（Bacilus）。革蘭氏染色陽性，大小為（0.3-2.2）umx（1.2-7.0）um；周生或側(cè)生鞭毛；無莢膜；芽孢中生或近中生，大小0.5um×（1.5~1.8）um。菌落形態(tài)不規(guī)則；表面粗糙，不透明，污白色或微黃色。枯草芽孢桿菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種中的員，可用于生產(chǎn)、蛋白酶、核苷酸酶、氨基酸和核苷等。

（3）北京棒狀桿菌（Corynebacterium pekinensis）

革蘭氏染色陽性，短桿狀或小棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，不分枝，單個或呈“八"字排列，無芽孢，不運動。北京棒狀桿菌是我發(fā)酵的主要生產(chǎn)菌種中的員。

2.常見的放線菌

（1）鏈霉菌屬（Streptomyces）

菌絲發(fā)達無隔膜，直徑約0.4~1um，長短不，多核。菌絲體有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分。鏈霉菌屬是抗生素的主要生產(chǎn)菌。常用的抗生素，如、、、、、、井岡霉素等，都是鏈霉菌屬產(chǎn)生的次代謝產(chǎn)物。

（2）諾卡菌屬（Nocardia）

諾卡菌屬又稱原放線菌屬（proactinomyces）。菌絲體能產(chǎn)生橫膈膜，多數(shù)種只有營養(yǎng)菌絲，沒有氣生菌絲。菌落般比鏈霉菌屬小，表面崎嶇多皺，致密干燥。諾卡菌主要分布在土壤中，能產(chǎn)生30多種抗生素，如、間型霉素等。此外，有些諾卡菌還用于石油脫蠟、烴類發(fā)酵及脯類化合物的轉(zhuǎn)化。

3.常見的酵母菌

（1）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

細(xì)胞多為圓形或卵圓形，長寬比約1~2。它是發(fā)酵工業(yè)上常用的菌種中的員。它除了用于傳統(tǒng)的酒類（如啤酒、葡萄酒、果酒和蒸餾酒）的生產(chǎn)之外，工業(yè)上還用于酒精的發(fā)酵。

（2）產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）

細(xì)胞呈圓形、橢圓形或圓柱形，大小為（3.5～4.5）um×（7-13）um。它是人們研究多的生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物中的員。以無機氮為氨源，以五碳糖或六碳糖為碳源，在培養(yǎng)基中不需添加生長因子，它即可生長。它既能利用造紙工業(yè)的亞硫酸廢液，也能利用糖蜜、土豆淀粉廢料、木材水解液等生產(chǎn)出人畜可食用的單細(xì)胞蛋白。

4.常見的霉菌

（1）毛霉屬（Mucor）

屬接合菌亞門，毛霉目。菌絲無色透明，無橫隔，菌落初期為白色，后為灰白色、淡黃色或淡褐色，氣生，不產(chǎn)生匍匐菌絲，有孢子囊，能產(chǎn)生孢囊孢子。有性生殖時可形成球形的接合孢子。毛霉中的許多種分解蛋白質(zhì)能力很強，因此，豆腐乳、豆豉的制作均用毛霉。

（2）根霉屬（Rhizopus）

屬接合菌亞門，毛霉目。菌絲無色透明，無隔膜，不長氣生菌絲，只產(chǎn)生弧形的匍甸菌絲，有假根，有子囊，能產(chǎn)生孢囊孢子。根霉可分泌多種酶，如、蛋白酶等。它常用于釀酒業(yè)中淀粉的糖化。

（3）紅曲霉屬（Monascus）

紅曲霉菌落開始為白色，成熟后變?yōu)榧t紫色，能向培養(yǎng)基中分泌紅色色素。紅曲霉能產(chǎn)生、麥芽糖酶、蛋白酶、檸檬酸、琥珀酸、乙醇，以及天然食用色素，從而用于黃酒、醋、紅腐乳等的制作。

（4）青霉屬（penicilum）

青霉在自然界中分布很廣，是造成水果腐爛、糧食等工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品霉變的主要菌。不同菌種可形成不同的代謝產(chǎn)物，如有產(chǎn)的菌種，產(chǎn)的菌種，產(chǎn)檸檬酸、延胡索酸、草酸等有機酸的菌種，產(chǎn)纖維素酶、糖苷酶的菌種。個別青霉菌還能產(chǎn)生致癌的霉菌毒素。

（5）曲霉屬（Aspergillus）

曲霉為多細(xì)胞菌。菌絲有分隔，營養(yǎng)菌絲大多匍甸生長，無假根，能產(chǎn)生分生孢子。此屬在自然界分布廣，是引起多種物質(zhì)霉腐（如面包，煤生物分解及皮革變質(zhì)等）的主要微生物中的員。其中，黃曲霉具有很強毒性。綠色和黑色的具有很強的酶活性，在食品發(fā)酵中廣泛用于制醬、釀酒。曲霉在現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶等酶制劑。

二、菌種的分離篩選

微生物是地球上分布廣、種類豐富的生物種群。為了適應(yīng)環(huán)境壓力，微生物常常能產(chǎn)生許多特殊的生理活性物質(zhì)，所以微生物是人類獲取生理活性物質(zhì)的豐富資源。微生物菌種篩選包括采樣、富集培養(yǎng)、純種分離、初篩和復(fù)篩。

1.采樣

采集微生物樣品時，材料來源越廣泛，越容易獲得新的菌種。土壤具備微生物生長所需的營養(yǎng)、水分和空氣，是微生物菌種的主要來源。在實際采樣過程中，應(yīng)根據(jù)分離篩選的目的，選擇不同區(qū)域、有機質(zhì)含量、酸堿度、植被狀況的土壤去采集樣品。采土樣時，先用鏟除去表層土，取5~25cm深處的土樣10~15g，裝入事先準(zhǔn)備好的信封或塑料袋，并對其進行編號，記錄采樣地點、時間、土質(zhì)等。取樣后，應(yīng)盡早分離，以避免不能及時分離而導(dǎo)致微生物死亡。

同時還可以根據(jù)所篩選微生物目的、特殊生理特點等進行采樣。如篩選纖維素酶產(chǎn)生菌，可選擇有很多枯枝落葉、富含纖維素的森林土；篩選蛋白酶產(chǎn)生菌株，可選擇肉類加工廠、飯店排水溝的污泥；篩選產(chǎn)生菌，可選擇面粉廠、酒廠、糕點廠等場所的土壤；篩選酵母菌，可選擇果園土壤或蜜錢、甘蔗堆積處。在高溫、低溫、酸性、堿性、高鹽、高輻射強度的特殊環(huán)境下，往往能篩選到端微生物。溫泉、火山爆發(fā)處、堆肥處，往往能篩選到高溫微生物；南、北地區(qū)、冰窖、海洋深處，往往能篩選到低溫微生物；海洋底部往往能篩選到耐壓菌。

2.富集培養(yǎng)

在自然界采集的土樣，是多種類微生物的混合物，目的微生物通常不是優(yōu)勢菌，數(shù)量較少。通過富集培養(yǎng)增加待分離微生物的相對或數(shù)量可增加分離成功率。富集培養(yǎng)是根據(jù)微生物生理特點，設(shè)計種選擇性培養(yǎng)基，將樣品加到培養(yǎng)基中，經(jīng)過段時間的培養(yǎng)，目的微生物迅速生長繁殖，數(shù)量上占了定的優(yōu)勢，從中可有效分離目的菌株。在富集培養(yǎng)中，既可以通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件增加目的微生物的數(shù)量，也可通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，增加目的微生物的相對數(shù)量，從而達到富集的目的。如篩選纖維素酶產(chǎn)生菌，可選擇以纖維素為碳源的培養(yǎng)基，使目的菌迅速生長繁殖，而其他不能利用纖維素的非目的菌不能生長或生長緩慢。從土壤中篩選芽孢桿菌時，先將樣品在80℃加熱10min，以殺死不產(chǎn)芽孢的微生物，再進行富集培養(yǎng)，就可以達到目的菌優(yōu)勢生長。

富集培養(yǎng)在那些樣品中目的微生物含量較少的情況下是必要的。但是如果樣品中已含有較多數(shù)量的目的微生物，則不必進行富集培養(yǎng)，將樣品稀釋后直接在培養(yǎng)基平板上進行純種分離即可。

3.純種分離

純種分離常采用稀釋法和劃線法。稀釋法是將樣品先用無菌水稀釋，再涂布到固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后獲得單菌落。劃線法是用接種環(huán)挑取微生物樣品在固體培養(yǎng)基平板上劃線，培養(yǎng)后獲得單菌落。稀釋法能使微生物樣品分散更加均勻，更容易獲得純種；而劃線法更簡便、快速。

純種分離中通常使用分離培養(yǎng)基對微生物進行初步的分離。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物的特殊生理特性或其代謝產(chǎn)物的生化反應(yīng)而設(shè)計的培養(yǎng)基，可顯著提高目的微生物分離純化的效率。常用的分離方法包括透明圈法、變色圈法、生長圈法和抑菌圈法等。

4.初篩和復(fù)篩

在純種分離過程中，對于有些微生物，可通過代謝產(chǎn)物與指示劑、顯示劑或底物的生化反應(yīng)在分離培養(yǎng)基平板上直接定性分離。對于這類微生物，純種分離后可直接在瓊脂平板上進行初篩。但并不是所有的微生物都可以用瓊脂平板定性分離，往往需要采用搖瓶培養(yǎng)法進行初篩，再對生產(chǎn)性能進行測定。初篩要求篩選到盡可能多的菌株，工作量很大，因此，設(shè)計種快速、簡便的篩選方法往往會事半功倍。

初篩得到的菌株需要進步通過復(fù)篩，以獲得較好的菌株。復(fù)篩通常采用搖瓶培養(yǎng)法，產(chǎn)物的檢測通常采用更為精確的定量測定方法。