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 為活細(xì)胞研究設(shè)計(jì)光學(xué)顯微系統(tǒng)時(shí)，首要考慮的是檢測(cè)器的敏感度（對(duì)信號(hào)乃至噪音的檢測(cè)），圖像獲取的速度，以及在此基礎(chǔ)上標(biāo)本的可行性。對(duì)于固定細(xì)胞的成像，曝光時(shí)間及光強(qiáng)度相對(duì)來(lái)說(shuō)都很高，這時(shí)可能會(huì)造成光漂白；然而對(duì)于活細(xì)胞成像，上述光的影響必須去除。幾乎在所有情況下，活細(xì)胞顯微鏡都會(huì)在盡可能高的圖像質(zhì)量與盡可能好的細(xì)胞活性之間取得一個(gè)平衡。對(duì)于此類(lèi)實(shí)驗(yàn)，時(shí)間及空間上的分辨率需要設(shè)定在能滿足實(shí)驗(yàn)要求的水平上，而不是給予過(guò)度的光照或設(shè)定過(guò)多采樣時(shí)間點(diǎn)。

 

 

 

基本上,一個(gè)理想的活細(xì)胞成像系統(tǒng)必需有足夠的敏感度，來(lái)滿足在弱熒光條件下仍能得到高圖片質(zhì)量；同時(shí)，系統(tǒng)也必需足夠快，以記錄整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程。 另外，這個(gè)系統(tǒng)還需要有足夠高的分辨率以捕捉樣品細(xì)節(jié)，并且能夠準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)測(cè)量每個(gè)微小的光強(qiáng)變化。然而不幸的是，要改善上述的任意一條都需建立在犧牲其它性能的基礎(chǔ)上。因此現(xiàn)在還不能夠設(shè)計(jì)出一個(gè)可以滿足所有要求的活細(xì)胞成像體系。研究人員現(xiàn)在只能在盡量減低不重要的信息的遺失的同時(shí)，盡可能的獲得zui優(yōu)的重要參數(shù)。這樣，顯微鏡的配置zui終取決于成像的要求，對(duì)于樣品在實(shí)驗(yàn)期間活性的要求，進(jìn)行標(biāo)記的難度水平，以及儀器的可用性等實(shí)際因素。

如圖一（Figure 1）所示為一臺(tái)倒置研究級(jí)顯微鏡，它配有四個(gè)相機(jī)接口，并可滿足對(duì)培養(yǎng)的組織的研究。在四個(gè)接口上分別配有四個(gè)不同的相機(jī)，每一個(gè)都用來(lái)獲取不同的圖像。在大多數(shù)情況下，這種顯微鏡的分光設(shè)計(jì)是100％進(jìn)入相機(jī)或以80：20的比例同時(shí)分配給相機(jī)和目鏡。在弱光成像時(shí)，研究人員必需確保將zui敏感的相機(jī)接在100％分光口上。在圖一中，彩色CCD（Full color CCD）接在顯微鏡的底部（a），它從物鏡接受的光信號(hào)不經(jīng)過(guò)棱鏡或反光鏡的反射。這樣的相機(jī)通常用來(lái)進(jìn)行多色熒光或明場(chǎng)拍攝。顯微鏡右側(cè)連接的電子倍增電荷偶聯(lián)設(shè)備（Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD）（b），它通常用來(lái)檢測(cè)極弱的熒光信號(hào)。接在顯微鏡左側(cè)的相機(jī)（c）配有一個(gè)高量子效應(yīng)的感應(yīng)器，可以感應(yīng)700－1000nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，所以這個(gè)相機(jī)可以用來(lái)進(jìn)行微分干涉相稱(chēng)（differential interference contrast，DIC）觀察方法下厚標(biāo)本的紅外線照明成像。zui后，對(duì)于高分辨率的單色熒光成像，如全內(nèi)反射熒光或其它熒光技術(shù)，圖一中的顯微鏡在前部（d）配備了Peltier-cool 相機(jī)。這個(gè)相機(jī)zui小像素點(diǎn)為6μm，適合于此類(lèi)成像的需求。如圖一中的配置非常昂貴，但是它能滿足用戶所有的成像要求。

進(jìn)行活細(xì)胞成像的光學(xué)顯微鏡需要寬光譜增稱(chēng)模塊。大多數(shù)的研究者使用熒光顯微鏡，通常還會(huì)配合一種或多種透射光技術(shù)。其中熒光技術(shù)包括了傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)落射熒光，激光掃描共聚焦，真空碟片共聚焦，場(chǎng)掃描共聚焦，多光子，全內(nèi)反射（TIRF），熒光關(guān)聯(lián)光譜，熒光壽命成像（FILM），光活化，鐳射陷阱等技術(shù)。相應(yīng)的成像技術(shù)有光譜成像，多色成像，共定位，時(shí)間序列，熒光光漂白恢復(fù)，（FRAP，FLIP，FLAP），熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），熒光散斑顯微鏡，膜片鉗技術(shù)等，以上這些技術(shù)通常要配合一種或多種基礎(chǔ)成像技術(shù)。當(dāng)熒光與明場(chǎng),DIC,霍夫曼調(diào)制相稱(chēng)（HMC）,相差等技術(shù)相結(jié)合時(shí),熒光技術(shù)作為探針,可用于定位.對(duì)于絕大多數(shù)的活細(xì)胞成像來(lái)說(shuō),顯微鏡的配置都需要滿足一些特定的需要以保證試驗(yàn)能夠成功進(jìn)行。除了顯微鏡與數(shù)字成像系統(tǒng)，活細(xì)胞成像還需要考慮到兩個(gè)限制因素——一個(gè)是保持細(xì)胞的活性，另一個(gè)是在北京噪音及自發(fā)熒光的基礎(chǔ)上盡可能的提高信號(hào)強(qiáng)度。

提高活細(xì)胞成像的信噪比

活細(xì)胞成像與固定細(xì)胞成像之間的基本區(qū)別是，后者的成像沒(méi)有過(guò)多的限制， 如合適視野的選定，曝光時(shí)間的設(shè)定，電子益增的設(shè)定，讀出率及,偏移值等。這樣，染色的固定樣品的成像就可以充分利用相機(jī)的全部動(dòng)態(tài)設(shè)定。因此，固定成像可以得到理想的信噪比。但不幸的是，由于細(xì)胞活性對(duì)照明的嚴(yán)格要求，活細(xì)胞成像的情況又與固定細(xì)胞的成像有所不同。在活細(xì)胞成像時(shí)，樣品的灰度往往比背景高不了多少。在這種情況下，成像首要考慮的是檢測(cè)系統(tǒng)的暗電流及噪音值。經(jīng)濟(jì)型的相機(jī)通常噪音都會(huì)比較高，導(dǎo)致背景混亂并掩蓋樣品信號(hào)，在讀出速率增加時(shí)這種影響更為嚴(yán)重。所以，幾乎所有的活細(xì)胞成像設(shè)備質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)都是檢測(cè)器的好壞。

數(shù)字圖像的噪音主要由四方面造成，檢測(cè)器，照明系統(tǒng)，Poisson 噪音或shot 噪音（由于光子通量的隨機(jī)性造成），以及彌散光。在大多數(shù)情況下，通過(guò)選擇好的檢測(cè)器或優(yōu)化照明條件可以降低系統(tǒng)噪音。事實(shí)上，任何一種光子檢測(cè)器在記錄的時(shí)候都會(huì)產(chǎn)生某種形式上的噪音。掃描光聚焦及多光子顯微鏡中的光電倍增管（PMT）會(huì)產(chǎn)生雜電子。同樣的，用于明場(chǎng)，全內(nèi)反射，針孔碟片共聚焦，場(chǎng)掃描顯微鏡的CCD也會(huì)生成背景暗電流。對(duì)此，CCD 及光電倍增設(shè)備也做了一系列的改進(jìn)，比如制冷設(shè)備，它會(huì)使儀器工作時(shí)保持在低溫狀態(tài)，從而降低暗電流的水平。然而，在讀取光信號(hào)并將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)的時(shí)候，特別是CCD這種儀器，也會(huì)產(chǎn)生噪音，即read noise，制冷數(shù)碼相機(jī)產(chǎn)生的主要噪音。

                                                                       

                             

Figure 2所示為影響活細(xì)胞成像質(zhì)量的數(shù)字相機(jī)的讀出速度與敏感度的相互依存關(guān)系。The specimen is a culture of human 圖中樣品為人的宮頸癌細(xì)胞（HeLa 細(xì)胞系），展示mKO（monomeric Kusabira Orange）熒光蛋白與人的α珠蛋白融合，圖片在寬視場(chǎng)熒光下單色相機(jī)拍攝，照明中添加TRITC濾片，讀出速度為10或1.25 MHz。Figures 2（a） & 2（b）所示，在關(guān)閉CCD 光閘的條件下，低讀出速度下的噪音要明顯高于高讀出速度下的噪音。但是，如果將CCD 調(diào)節(jié)到全動(dòng)態(tài)范圍的話，這方面的 影響就不明顯了，如Figures 2（c） & 2（d） 所示；然而，在低光照條件下，低讀出速度（Figure 2（f））的圖片質(zhì)量要明顯的優(yōu)于高讀出速度（Figure 2（e）。 Figures 2（e） & 2（f） 的照明強(qiáng)度大約是 Figures 2（c） & 2（d） 的十分之一。如將照明強(qiáng)度再降低5倍效果會(huì)更加明顯，如Figures 2（g） & 2（h），低讀出速度下的圖片至少還能夠表達(dá)出需要的效果（Figure 2（h）），然而高讀出速度下的成像質(zhì)量則很不理想（Figure 2（g））。

一個(gè)成功的數(shù)字成像實(shí)驗(yàn)，要求樣品的空間照明模式是連續(xù)的，即整個(gè)視野內(nèi)的照明是連續(xù)一致的，每次成像間的圖片也是連續(xù)一致的。這取決于照明光源，使用鎢鹵素?zé)粽彰鳎?/span>樣品的光學(xué)性質(zhì)在顯微鏡下通常都是連續(xù)的（被稱(chēng)為光學(xué)一致性）。然而使用激光掃描顯微鏡的照明裝置對(duì)某一特定的點(diǎn)進(jìn)行掃描，則每一次的掃描結(jié)果都不一樣。另外，使用汞燈（the mercury plasma arc-discharge lamp）作為寬視野熒光顯微鏡的照明光源，圖片結(jié)果會(huì)在光譜上體現(xiàn)為特定的分離的波長(zhǎng)峰值。相比之下氙燈（Xenon lamps）在可見(jiàn)光譜下的結(jié)果就相當(dāng)連續(xù)，÷但是在它在紫外區(qū)的結(jié)果不佳（這一光譜范圍通常不用于活細(xì)胞成像）。

對(duì)于金屬鹵素?zé)?/span>這樣的照明光源，它的特性介于汞燈與氙燈之間，也許是性能*的光源。金屬鹵素?zé)裟?/span>夠提供從紫外到紅外間連續(xù)的光譜，此外，保有汞燈的光強(qiáng)。除了調(diào)整照明光源，為了達(dá)到照明一致的效果，還可以在燈箱及顯微鏡的照明輸入端口之間添加一個(gè)光導(dǎo)纖維（或液體光導(dǎo)）。在視場(chǎng)中的照明梯度可以通過(guò)計(jì)算來(lái)矯正（flat-field algorithms）。燈泡有時(shí)在輸出的亮度會(huì)與平均值有10％的偏離，這時(shí)需要注意的是它不能夠通過(guò)光學(xué)纖維來(lái)矯正，而要使用穩(wěn)定的電源。

對(duì)光子通量的測(cè)量是統(tǒng)計(jì)學(xué)的處理，在檢測(cè)信號(hào)時(shí)會(huì)產(chǎn)生偏差。所謂的Poisson 或 shot noise（如前所述），它體現(xiàn)在測(cè)量N個(gè)光子時(shí)，出現(xiàn)的偏差與N的平方根成正比，即信噪比。所以，增加信號(hào)光子的數(shù)量N可直接提高信噪比及圖像對(duì)比度。提高信號(hào)zui簡(jiǎn)單的方法是手機(jī)更多的光子，通常做法是增加曝光時(shí)間或提高激發(fā)照明的強(qiáng)度，但是這些做法會(huì)增加光毒性并降低細(xì)胞活性。其次，另一個(gè)更有用的方法是加強(qiáng)檢測(cè)器的敏感度。

為了解決活細(xì)胞成像低光照的問(wèn)題，現(xiàn)在的數(shù)字CCD 相機(jī)檢測(cè)器更加敏感，這是通過(guò)面元劃分（binning）來(lái)實(shí)現(xiàn)的（如Figures 3 & 8所示）。一般CCD讀取像素點(diǎn)會(huì)將橫向上的像素值轉(zhuǎn)移到只讀寄存器上，然后進(jìn)行順序分析。在binning 處理時(shí)，相互臨近的一群光信號(hào)會(huì)被合在一起檢測(cè)（2 x 2 或 4 x 4）為一個(gè)信號(hào)值進(jìn)行輸出。這通過(guò)將多行像素轉(zhuǎn)移到一系列只讀寄存器（比如兩行進(jìn)行 2 x 2 binning ，四行進(jìn)行4 x 4 binning）中然后多行同時(shí)讀取來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在2 x 2 binning 情況下，空間分辨率會(huì)降低一半，信號(hào)強(qiáng)度增加4倍，信噪比增加2倍。很明顯，雖然降低了空間分辨率，但對(duì)于弱信號(hào)強(qiáng)度的提高是很顯著的。

 

 

 

Figure 3顯示的是將臨近的像素結(jié)合在一起并不斷的增加binning 水平，對(duì)數(shù)字圖像的空間分辨率及zui終尺寸的影響。樣品為印度麂鹿皮膚組織的纖維原細(xì)胞，它表達(dá)mCherry 熒光蛋白（紅色偽彩）及人的β肌動(dòng)蛋白，位于應(yīng)力纖維組成的絲狀細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)中。通常在進(jìn)行熒光蛋白標(biāo)記時(shí)，表現(xiàn)出很好的共定位的細(xì)胞常常表達(dá)很低水平的融合蛋白，其發(fā)出的信號(hào)極微弱。如果不用binning處理（Figure 3（a）），在不產(chǎn)生光毒性及光漂白的曝光時(shí)間下得到的信號(hào)弱到無(wú)法辨別。Binning 2 x 2 漸進(jìn)到 4 x 4增加了信號(hào)水平，但降低了空間分辨率（Figures 3（b） and 3（c））。在binning 8 x 8 像素下的圖像（Figure 3（d））zui亮。但分辨率降低極多。另外很重的一點(diǎn)是，在binning 處理時(shí)，增加合并像素點(diǎn)，圖像尺寸按比例縮小例如，不進(jìn)行binning 處理（1 x 1）的圖像（Figure 3）的原始大小為1360 x 1024 （pixels），在（2 x 2）, （4 x 4）, 及 （8 x 8） 處理條件下的圖像分辨率分別為680 x 512, 340 x 256, 及 170 x 128 （pixels）。如上所述，這些圖像的尺寸被縮小了。同樣的，一個(gè)512 x 512 的數(shù)碼相機(jī)在進(jìn)行上述比例處理時(shí)，圖像的大小將分別縮小為256 x 256, 128 x 128, and 64 x 64 （pixels）。

Binning 處理的重點(diǎn)是讀出噪音產(chǎn)生在binning 處理后，所以雖然讀取了幾個(gè)像素的集合，但是每個(gè)binning處理后的像素只讀取一次。相對(duì)的，像 2 x 2 這樣的像素集合，如果先收集信號(hào)再進(jìn)行平均計(jì)算，那么由于每個(gè)點(diǎn)都會(huì)產(chǎn)生噪音，這樣的結(jié)果會(huì)比binning差。因此，雖然binning處理會(huì)降低空間分辨率，但是這樣的處理可以顯著提高空間分辨率，這在光敏細(xì)胞的試驗(yàn)中是非常有意義的，因為在這樣的試驗(yàn)中，光照水平非常的低，而且曝光時(shí)間和很短。在活細(xì)胞成像中zui重要的參數(shù)通常是檢測(cè)若熒光信號(hào)的能力，而不是空間分辨率，所以，通過(guò)binning 處理提高敏感度及縮短曝光時(shí)間是成像的重點(diǎn)，不需太多考慮空間分辨率。除binning 處理外，許多相機(jī)通過(guò)小范圍拍攝或只拍攝感性的區(qū)域來(lái)縮短曝光時(shí)間，這種拍攝方法可以在保有空間分辨率的同時(shí)減少曝光對(duì)細(xì)胞的損害。

克服常規(guī)相機(jī)的缺點(diǎn)

 

為了滿足極低照明下高速成像的需求，開(kāi)發(fā)商們推出了一種有效的放大弱信號(hào)的相機(jī)，EMCCD。這種EMCCD 通過(guò)芯片上益增寄存器進(jìn)行信號(hào)放大，敏感度能夠達(dá)到單光子檢測(cè)級(jí)別，同時(shí)不會(huì)像傳統(tǒng)CCD 一樣降低量子效率和空間分辨率。EMCCD 的一個(gè)顯著特性是，通過(guò)芯片上專(zhuān)門(mén)的外延串行寄存器，在硅亞結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生碰撞電離過(guò)程中進(jìn)行增益。（Figure 4）. 由光子激發(fā)出的電荷要高于讀出噪音，這即使在高幀頻下也能實(shí)現(xiàn)，并且對(duì)于現(xiàn)在的任何CCD 都使用，包括背照芯片CCD（back-illuminated CCD）。

 

 

 

EMCCD 的優(yōu)越性在于由于放大過(guò)程直接發(fā)生在CCD 的結(jié)構(gòu)內(nèi)，它要比其它的強(qiáng)化CCD（intensified CCDs）便宜一些。對(duì)于單分子成像，全內(nèi)反射，針孔碟片場(chǎng)掃描共聚焦離子通量檢測(cè)實(shí)時(shí)3D試驗(yàn)等弱信號(hào)的測(cè)定，EMCDD 要比其它針對(duì)弱光的感光原件好很多。另外，如果使用傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)，EMCCD極高的敏感性可以在弱光及/或低激發(fā)強(qiáng)度下得到高信號(hào)強(qiáng)度，這樣，可以降低光毒性及熒光的光漂白。

顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)

用于活細(xì)胞成像的顯微鏡的結(jié)構(gòu)必需足夠堅(jiān)固，或者是鋁制的，同時(shí)，也要足夠穩(wěn)固防震。而顯微鏡外露的光學(xué)表面及聚光鏡，燈箱，物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)等裝置必需保持潔凈，存放顯微鏡的房間要保持低濕度的無(wú)塵狀態(tài)。在活細(xì)胞成像的日常使用時(shí)，必需保證所有的光學(xué)通路及光圈在同一軸線上，并應(yīng)用克勒照明。存放顯微鏡的房間也有相應(yīng)要求，室內(nèi)不要安裝頂燈，以減少直接進(jìn)入目鏡及樣品處的光線。

電子數(shù)字相機(jī)通常通過(guò)專(zhuān)用的接口接在顯微鏡的一個(gè)或幾個(gè)相機(jī)接口上。研究級(jí)的顯微鏡通常有多個(gè)接口同時(shí)連接幾個(gè)相機(jī)（如 Figure 1）。這對(duì)于需要使用不同手段得到*圖像效果的顯微成像是十分有用的。在顯微鏡機(jī)身內(nèi)部有一系列反光鏡，分光鏡，棱鏡分別被安置在恰當(dāng)的位置以將光信號(hào)反射到不同的相機(jī)接口及目鏡中。需要注意的是，由于部分光進(jìn)目鏡而減少了進(jìn)入相機(jī)接口的光線，相機(jī)成像的信噪比會(huì)降低。因此，在配置顯微鏡時(shí)，應(yīng)該將若熒光照相的分光口的分光率設(shè)置為100％。

物鏡負(fù)責(zé)收集由樣品發(fā)出的光線，并將其傳到顯微鏡的光學(xué)組件中，因此，物鏡的選擇是至關(guān)重要的。在光路中的光學(xué)組件，如反光鏡，分光鏡，聚光透鏡，濾光鏡，棱鏡等會(huì)嚴(yán)重的降低信噪比，所以，這種效應(yīng)必需降低。在熒光成像時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用高數(shù)值孔徑的物鏡，因為它能夠盡可能多的收集由樣品發(fā)射出的光線。數(shù)值孔徑（Numerical aperture）體現(xiàn)了其棱鏡能夠從單一點(diǎn)光源收集光線的能力，因此，對(duì)于活細(xì)胞成像，數(shù)值孔徑是zui重要的考慮因素。其數(shù)值標(biāo)注在物鏡筒上，大小從0.25（低放大倍數(shù)，如10x干鏡）到1.20（水鏡）及1.45（油鏡，40x - 100x范圍）不等。數(shù)值孔徑的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

Numerical Aperture （數(shù)值孔徑，NA） = Refractive Index （折射率，η） × Lens Acceptance Angle （鏡口角的正弦值，sin（θ））

因此，物鏡對(duì)光的收集能力與物鏡前透鏡及樣品間介質(zhì)的折射率有關(guān)，與鏡口角的正弦值有關(guān)。數(shù)值孔徑為物鏡分辨率數(shù)學(xué)表達(dá)式的一個(gè)因數(shù)。根據(jù)瑞利判據(jù)（Rayleigh criterion，一種保守的估計(jì)），分辨率等于照明光波長(zhǎng)與一個(gè)常數(shù)（1.61）的乘積與數(shù)值孔徑的商。另外，數(shù)值孔徑還決定了圖像的亮度，圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比，與放大倍數(shù)的二次方成反比。所以，稍微提高數(shù)值孔徑都能夠顯著地提高信號(hào)強(qiáng)度。因此活細(xì)胞成像要求使用數(shù)值孔徑zui高的物鏡及高折射率的浸入物（油或水）。

如上，圖像的亮度與物鏡放大倍數(shù)的二次方成反比，因此弱信號(hào)成像使用低倍數(shù)的物鏡。比如說(shuō)，在100x數(shù)值孔徑1.4的物鏡下觀察樣品，如果這個(gè)時(shí)候信噪比成為影響圖片質(zhì)量的主要因素，那么將物鏡轉(zhuǎn)換到60x或40x，則同樣的數(shù)值孔徑下圖片的亮度會(huì)得到顯著的提高。事實(shí)上，將60x/1.4與100x/1.4的物鏡進(jìn)行對(duì)比，對(duì)同一張熒光圖像成像，前者要比后者亮三倍。觀測(cè)強(qiáng)度也是衡量物鏡透光能力的一個(gè)因素。在某些試驗(yàn)中，為了達(dá)到要求的放大率，通常要將放大與binning 處理借個(gè)起來(lái)。

在多重標(biāo)記的固定細(xì)胞試驗(yàn)中（有時(shí)也能是活細(xì)胞試驗(yàn)），具有色差及平場(chǎng)矯正的物鏡是的。然而不幸的是，復(fù)消色差物鏡和平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡中相對(duì)于消色差物鏡和螢石物鏡（低度物鏡）來(lái)說(shuō)，不可避免的添加了很多光學(xué)器件（透鏡）。高矯正的物鏡不會(huì)生成假象，可應(yīng)用于透射光技術(shù)，如相差，DIC等。然而，矯正的結(jié)果降低了光透過(guò)率，這對(duì)固定細(xì)胞的成像不會(huì)有很大的影響，但是對(duì)活細(xì)胞成像來(lái)說(shuō)卻不然。闡述這種現(xiàn)象的例子是，一個(gè)40x/1.4的平場(chǎng)復(fù)消色差的物鏡，理論上要比同類(lèi)100x物鏡亮六倍，但實(shí)際上，前者的亮度只有后者的四倍左右。但無(wú)論如何，40x及60x的物鏡在光學(xué)分辨率極限下，仍能提供zui亮的圖片。

 

 

 

如Figure 5 所示，為就圖像分辨率及亮度方面，物鏡數(shù)值孔徑的重要性。樣品為非洲綠猴的腎臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)物 （CV-1 line），用表達(dá)特異結(jié)合線粒體的EGFP 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該培養(yǎng)物，在熒光顯微鏡下可以觀測(cè)到線粒體在細(xì)胞中的網(wǎng)絡(luò)分布。

Figure 5 為平場(chǎng)螢石物鏡下相同視野的圖片（數(shù)值孔徑1.3，放大倍數(shù)由40x到100x不等）。雖然圖中的拍攝條件及矯正手段相同，但40x下的線粒體要比其它條件的亮（Figure 5（a），圖片大小為經(jīng)調(diào)整）。相比之下，60x及100x下的圖片逐漸變暗，100x下的線粒體幾乎不可見(jiàn) （Figures 5（b） & 5（c））.這樣的物鏡仍然可用，但是必需放大檢測(cè)器的增益值，這樣一來(lái)信噪比就會(huì)降低，圖片質(zhì)量也相應(yīng)下降。 需要注意的是，由于數(shù)值孔徑相同，從Figures 5（d）到5（f）的分辨率是一樣的。

    以上的例子說(shuō)明在選擇活細(xì)胞成像的物鏡時(shí)，如果樣品標(biāo)記熒光，則不要盲目的追求放大倍數(shù)。對(duì)共聚焦顯微鏡的40x或60x物鏡來(lái)說(shuō)來(lái)說(shuō)，在成像時(shí)進(jìn)行放大后的結(jié)果和100x物鏡的成像效果相同（Figures 5（d） and 5（e））。由于具有相同的數(shù)值孔徑，兩個(gè)物鏡的分辨率是一樣的。但這種說(shuō)法并不是說(shuō)60x或100x 的物鏡沒(méi)有任何作用。事實(shí)上，觀察小樣品通常要使用高倍數(shù)的物鏡，比如寬視場(chǎng)顯微鏡下觀察過(guò)氧化物酶體和分泌顆粒。由于圖像大小通常與檢測(cè)器的尺寸有關(guān)，所以，光學(xué)成像zui終的放大率取決于CCD的參數(shù)（像素點(diǎn)大小，中間變倍等）。因此，物鏡的選擇通常要考慮光學(xué)顯微鏡的配置，以及試驗(yàn)的特殊要求。

信噪比比分辨率的影響更大的時(shí)候，要選擇矯正度低的物鏡，這樣的物鏡中光學(xué)原件更少，相對(duì)的光的透過(guò)率會(huì)顯著提高。同樣的，相差物鏡中的光學(xué)器件也會(huì)減少光的透過(guò)率。這種水平的減少在透射光成像時(shí)不會(huì)有影響，但是在熒光成像時(shí)大概會(huì)減少15 %-20％的光透率。因此，在進(jìn)行活細(xì)胞成像時(shí)，如果試驗(yàn)用的熒光標(biāo)記較弱，則不能用相差物鏡，除非實(shí)驗(yàn)步驟方面有特殊的要求。同樣的，當(dāng)試驗(yàn)要求將熒光圖片同DIC圖片進(jìn)行疊加時(shí)，在熒光成像前要將物鏡下方的偏光裝置拿開(kāi)，因為它大概會(huì)減少30％ 的透光率。

    光路中的任何缺陷都會(huì)直接影響zui終成像的信噪比。對(duì)于活細(xì)胞成像來(lái)說(shuō)必需消除高數(shù)值孔徑物鏡的球差。通常引起球差的因素有培養(yǎng)液及物鏡浸入物等。球差是由于光沿光軸不均勻分布造成的，會(huì)導(dǎo)致成像變形。由于成像樣品通常較大，球差還會(huì)影響信噪比。這個(gè)問(wèn)題在對(duì)厚組織成像時(shí)要比薄層細(xì)胞成像時(shí)嚴(yán)重很多，由于水的折射率與培養(yǎng)基的折射率接近，通常使用水鏡來(lái)消除這個(gè)問(wèn)題。另外一種方法是矯正因培養(yǎng)基或蓋玻片導(dǎo)致的折射率的改變。由于折射率會(huì)受溫度影響發(fā)生變化，所以，在室溫下與在37攝氏度下的浸入物及蓋玻片厚度需要做適當(dāng)調(diào)整。的物鏡可通過(guò)矯正環(huán)來(lái)消除溫度引起的折射率的改變。

 

 

 

如 Figure 6 所示，為顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)（a）及數(shù)碼相機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)（b）對(duì)活細(xì)胞成像的影響。圖中樣品為鼠袋鼠腎臟的一個(gè)上皮細(xì)胞（PtK2 line），該細(xì)胞表達(dá)EGFP，EGFP與H2B組蛋白結(jié)合定位于細(xì)胞核。觀察方法為寬視場(chǎng)落射熒光。如圖，左圖右下方及右圖左下方為分辨率*的兩張。在活細(xì)胞顯微成像方面，光學(xué)系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑及光源的波長(zhǎng)決定了圖像對(duì)比度與物理分辨率。在左圖中，隨著照明強(qiáng)度的增加，圖像中的噪音明顯減少；隨著光學(xué)分辨率的提高，細(xì)胞核中的細(xì)節(jié)變得更加清晰。

在右圖中，圖像質(zhì)量隨著灰度及空間分辨率改變。增大像素尺寸，圖像的細(xì)節(jié)變得模糊不清，圖像幾乎無(wú)法辨認(rèn)；而降低灰度，會(huì)改變圖像外形，并僅呈現(xiàn)出具有高對(duì)比度的信息。以上兩種因素共同改變圖像質(zhì)量，同樣，在活細(xì)胞成像試驗(yàn)中以上因素需要根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行配置。

在活細(xì)胞成像試驗(yàn)中還應(yīng)用了各種濾色片及反光鏡，它們的作用是調(diào)整從照明器經(jīng)顯微鏡到檢測(cè)器中光的波長(zhǎng)。在透射光系統(tǒng)中這些增稱(chēng)光學(xué)組件包括起偏器，棱鏡（DIC），聚光鏡環(huán)，相差環(huán)等。在透射光成像系統(tǒng)中，如明視野，DIC，相差等，光的強(qiáng)度要比熒光大得多，所以，為了提高信噪比，需要在光路中添加一些組件。其中首要考慮的是過(guò)濾金屬鹵素?zé)舻淖贤饧凹t外波段的光以保護(hù)樣品。紅外線產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)損害細(xì)胞活性，并會(huì)降低紅外敏感CCD 成像的信噪比。紫外線很少出現(xiàn)在透射光源中，為了阻止這些波長(zhǎng)范圍的光，只需添加綠光片或紅光片即可。紅外及可見(jiàn)光濾光片都會(huì)顯著降低光強(qiáng)，所以在成像時(shí)需要增加曝光時(shí)間及增益以保證適宜的信噪比。

在熒光成像中，為了保證激發(fā)光及發(fā)射光的波長(zhǎng)在適宜的范圍內(nèi)，會(huì)在光路中添加濾光片及半透半反濾光片。在相對(duì)光強(qiáng)較低的熒光成像中，選擇濾光片首要考慮的是它是否能提供適宜的信噪比。大多數(shù)情況下，光會(huì)不分波長(zhǎng)大量的通過(guò)光學(xué)組件以至于掩蓋了熒光染料發(fā)出的信號(hào)，這時(shí)帶通濾色片就顯得非常重要。通常這中窄波段的濾色片會(huì)限制絕大部分光透過(guò)，所以，為了得到滿意的圖片，研究人員必需選擇適宜帶寬的濾色片。

現(xiàn)在，市場(chǎng)上有很多廠商提供特制的帶通濾色片及半透半反濾色片組合。在為活細(xì)胞成像選擇濾片組時(shí)，為了得到好的信噪比，所選的組合要zui接近熒光子的光譜性質(zhì)。例如，選擇標(biāo)準(zhǔn)的多色熒光成像FITC 濾色片組專(zhuān)門(mén)為進(jìn)行YFP成像時(shí)，就不需要為了提高信噪比而濾掉部分YFP 范圍內(nèi)的光（Figure 7（a））。在這種情況下，選擇符合YFP 吸收及發(fā)射波段的帶通激發(fā)光濾色片及長(zhǎng)通發(fā)射光濾色片會(huì)得到*的效果。

 

 

 

再舉一個(gè)兩個(gè)熒光蛋白衍生物波段的選擇實(shí)例（Figure 7）。圖中上部為YFP 的變種Venus 的激發(fā)及吸收光譜，它配合FITC 濾片組及寬波段發(fā)射光光譜以達(dá)到的信號(hào)收集效果。發(fā)射光濾色片的選擇與檢測(cè)器收集的信號(hào)直接相關(guān)，而上述組合顯然不如寬帶通YFP 組和收集的信號(hào)多。 同樣的，TRITC 濾片組（Figure 7（c））在mCherry 熒光蛋白的激發(fā)波段不如Texas Red 濾片組（Figure 7（d））效率高。另外，Texas Red 濾片組的發(fā)射光波段更寬，允許檢測(cè)器收集更多的信號(hào)。所以，在為活細(xì)胞成像選擇熒光基團(tuán)時(shí)需要配合濾片組合一起考慮，以保證得到*的激發(fā)及發(fā)射信號(hào)。

現(xiàn)在有更多的帶寬組合可供多色熒光標(biāo)記同時(shí)成像。另外還需要考慮的是在顯微鏡光學(xué)組件中添加中性密度濾色片來(lái)降低激發(fā)及發(fā)射強(qiáng)度——這在活細(xì)胞成像中是重要的，如同阻擋或減少紫外，紅外線的細(xì)胞光毒性。這些濾色片通常放在顯微鏡光源接口處，并可以隨時(shí)取出以增加光強(qiáng)。通過(guò)顯微鏡的光強(qiáng)及數(shù)值孔徑可以通過(guò)聚光鏡或落射照明器的孔徑光闌及視場(chǎng)光闌進(jìn)行調(diào)節(jié)。

 

檢測(cè)器幾何形狀與光學(xué)分辨率間的匹配

由于樣品有檢測(cè)器成像，圖像的空間分辨率取決于光學(xué)系統(tǒng)的分辨率。因?yàn)?/span>CCD 的檢測(cè)器有一列光電二極管組成，每個(gè)都有固定的尺寸，所以，每個(gè)像素的幾何學(xué)特性限制了圖像的zui終的分辨率。為了達(dá)到顯微鏡的分辨率，檢測(cè)器的尺寸要符合Nyquist 抽樣標(biāo)準(zhǔn)——2.5-3 pixels/Airy disk unit。舉個(gè)例子，對(duì)于光學(xué)分辨極限250 nm，圖像zui終的像素大小應(yīng)接近80-100 nm。對(duì)活細(xì)胞成像來(lái)說(shuō)，信噪比要比空間分辨率更重要，所以*的成像方式為2 pixels/Airy disk，這種方式不會(huì)對(duì)圖像質(zhì)量造成明顯損害。降低每個(gè)像素與Airy Unit的比例會(huì)增加圖像的亮度，并且可以使用更大的CCD 光電二極管，以累積更多的光電子。

Figure 8（a） 中描述的是應(yīng)用高數(shù)值孔徑物鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像時(shí)Airy disk 與CCD 像素列陣的投射關(guān)系。列陣中每個(gè)像素大小為6μm。100x/N.A.1.4 的物鏡投影在CCD表面上的像直徑為20μm（Table 1），因此，可以達(dá)到Nyquist 抽樣標(biāo)準(zhǔn)（3.3 pixels/Airy unit）。在這樣的采樣頻率下，有充足的空白可以進(jìn)行2x2 的binning 處理。相對(duì)的相同數(shù)值孔徑下60x 物鏡的投影直徑為12 μm，剛好低于Nyquist 的下限。另外，即使將數(shù)值孔徑降到1.3，40x 物鏡投影直徑仍只有8.4μm ，需要連接放大接口才能達(dá)到Nyquist 分辨率標(biāo)準(zhǔn)。光電二極管列陣的像素尺寸可大可小以匹配顯微鏡的空間分辨率，而無(wú)需添加中間變倍體；或者可以配置一個(gè)特制的CCD 接口，這樣的接口中包含了一系列棱鏡系統(tǒng)。

Figure 8（b） 中顯示的為2x2 binning處理的原理圖，列陣中包含16個(gè)像素。曝光后，CCD 收集的光電子將進(jìn)行兩次平行遷移，然后，串行寄存器上發(fā)生兩次遷移，這樣一個(gè)像素上將收集4個(gè)像素（2x2 binning）的光電子，并將其傳輸?shù)捷敵龉?jié)點(diǎn)進(jìn)行放大。4x4 binning 的處理方式與此相同，在處理過(guò)程中收集列陣中16 個(gè)像素信號(hào)并在輸出前進(jìn)行放大，這樣一來(lái)可以顯著地增強(qiáng)信號(hào)，同時(shí)降低讀出噪音。如前面討論過(guò)的，binning 處理是活細(xì)胞成像中一個(gè)的弱信號(hào)收集方式，這種處理可以降低對(duì)低熒光表達(dá)量細(xì)胞的毒害。

 

 

 

 

實(shí)際上，由1.4數(shù)值孔徑的物鏡成的像，zui終大小介于100-120 nm 之間。將這樣大小的信號(hào)一合適的物理尺寸轉(zhuǎn)移到CCD 光電二極管中，需要考慮物鏡的放大倍數(shù)。例如，要達(dá)到60x/1.4 物鏡的zui大分辨率，光電二極管不能大于6μm ——大小取決于放大倍數(shù)及分辨率。然而，對(duì)100x/1.4 的物鏡來(lái)說(shuō)，光電二極管zui大可至10μm。因此可以很明顯的看出，只有當(dāng)CCD 的配合了適當(dāng)?shù)奈镧R，數(shù)字分辨率才會(huì)與光學(xué)分辨率相匹配。10μm光電二極管與100x 物鏡組合生成的圖片像素大小為100 nm；當(dāng)與60x 物鏡組合時(shí)生成的像素大小為167 nm，這時(shí)；圖片的分辨率會(huì)低一些。相比之下，6μm 光電二極管與60x 的物鏡配合則是*的，但是當(dāng)與100x物鏡組合時(shí)，則會(huì)取樣過(guò)度。這種情況下的取樣過(guò)度會(huì)降低圖像亮度，從而無(wú)法改善圖像分辨率。

從前面的討論看來(lái)，似乎想要得到理想的分辨率就得為不同的物鏡配不同的CCD。實(shí)際上，這種方法一點(diǎn)都不實(shí)際，所以，需要找到一個(gè)折衷的辦法。在有些情況下，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)在CCD 與顯微鏡之間添加一個(gè)耦合器來(lái)消除物鏡放大倍數(shù)造成的影響。例如，0.6x 的接口可以將100x 物鏡的投影大小降低到60x 物鏡的效果。通過(guò)售后經(jīng)銷(xiāo)商可以得到各種耦合器，可放大或縮小CCD 光電二極管上投影的大小。以上的建議中需要注意的是，這些組件添加或移除相對(duì)來(lái)說(shuō)非常容易，不要把CCD 從顯微鏡接口處拿下來(lái)，以防灰塵或顆粒進(jìn)入顯微鏡機(jī)體內(nèi)或相機(jī)成像傳感器上。清潔傳感器是件非常困難的事，尤其是要*清除那上面的每一個(gè)灰塵及顆粒。

 

與顯微鏡光學(xué)分辨率相匹配的像素大小

 

Table 1

現(xiàn)在許多為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)的CCD 的光電二極管大小在5-16μm 范圍內(nèi)，并可進(jìn)行binning 處理。如上討論，通過(guò)binning 處理，幾個(gè)光電二極管上的信息倍整合到一個(gè)單元中，從而有效的增大像素尺寸。6-8μm 大小的光電二極管可匹配60x 的物鏡，經(jīng)過(guò)2x2 binning 處理，可匹配100x 物鏡。這中情況下，使用高透過(guò)性的物鏡，可使100x 物鏡下成像更加明亮。這樣，100x 物鏡下，bin 2 下的圖片幾乎是60x 物鏡下，bin 1 圖片亮度的二倍，而分辨率近似或高于bin 1。當(dāng)要求更高的敏感度時(shí)，使用60x 物鏡進(jìn)行2x2 binning 處理可以增加圖像亮度，這時(shí)對(duì)于活細(xì)胞成像來(lái)說(shuō)，分辨率上的損失在可接受范圍內(nèi)。

在一些實(shí)驗(yàn)中，例如大群細(xì)胞的同時(shí)成像，獲得視野內(nèi)更多的信息要比空間分辨率重要。在沒(méi)有中間變倍體的情況下，CCD 的矩形傳感器無(wú)法獲取目鏡視野內(nèi)所有的信息，通常只有30-80% 左右，大小取決于芯片尺寸。如果要獲取更大的圖片，需要添加一個(gè)具縮小功能的耦合器（如前所述）。通常0.6x的透鏡就可以使整個(gè)視野內(nèi)的圖片投影到芯片上，但同時(shí)會(huì)降低一些分辨率。如果要保有圖像分辨率，可以通過(guò)x-y 掃描獲取多張圖片然后用軟件進(jìn)行拼接。

光學(xué)顯微鏡上使用近紫外光源來(lái)獲得zui高分辨率。近紫外后，分辨力的順序是藍(lán)，綠，紅。在大多數(shù)情況下，研究人員使用金屬鹵素?zé)舢a(chǎn)生的寬光譜進(jìn)行照明，但是在活細(xì)胞成像中，照明光譜通常被濾色片控制在很窄的波段?？梢?jiàn)光譜中部波長(zhǎng)大約為550 nm，人眼zui敏感的綠色。Table 1 中的分辨率就是在這個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定的。所以在不同波長(zhǎng)下，這些值是不同的。數(shù)值孔徑也是重要因素，如表中所列，放大倍數(shù)相同的條件下，數(shù)值孔徑越高，分辨率越高。

 

總結(jié)

也許在活細(xì)胞成像中zui關(guān)鍵的就是在獲得zui高光學(xué)分辨率的同時(shí)平衡試驗(yàn)中信號(hào)強(qiáng)度（降低放大倍數(shù)），分辨率（提高放大倍數(shù)）及細(xì)胞活性間的關(guān)系。研究人員還必需選擇盡量少的透鏡來(lái)配合光學(xué)放大及檢測(cè)器像素尺寸。配合不同物鏡（放大倍數(shù)及數(shù)值孔徑）的各種類(lèi)型的中間變倍體都可以購(gòu)買(mǎi)得到，以滿足弱光及高分辨率試驗(yàn)的要求。在選擇物鏡放大倍數(shù)時(shí)，必需嚴(yán)格遵守Nyquist 分辨率標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)像素不得大于分辨率極限的一半；由于顯微鏡中衍射極限，工作距離通常不能小于50 nm。

活細(xì)胞成像用標(biāo)準(zhǔn)物鏡通常為10x 及40x 干鏡，及40x， 60x，100x 油鏡或水鏡。經(jīng)濟(jì)的低放大倍數(shù)的干鏡通常用來(lái)進(jìn)行初步檢測(cè)，比如找到細(xì)胞的位置，因此過(guò)高不需要光學(xué)矯正。然而浸潤(rùn)鏡頭則需要高數(shù)值孔徑（油鏡1.3-1,4，水鏡1.2），及高光透過(guò)性。由于圖片采集與視場(chǎng)中部，多以高平常物鏡并沒(méi)有多大意義，而同時(shí)這樣的物鏡昂貴并且光透性比其它物鏡低。所有用于熒光成像的物鏡都需要用熒光珠檢驗(yàn)其點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

無(wú)論落射熒光還是透射光（DIC 及相差），單色冷CCD 是成像的*選擇，這包括培養(yǎng)中的活細(xì)胞。在選擇相機(jī)時(shí)需要考慮的是量子效率，噪音水平（暗電流及讀出噪音），像素大?。皾M肼容量），及掃描頻率。為了減少光對(duì)樣品的損害，當(dāng)選擇高敏感度的相機(jī)，即高量子效率，低噪音，大像素尺寸，和低掃描頻率。因此，敏感度還需與分辨率（高分辨率，低像素尺寸）及顯像率（高掃描頻率）之間平衡。

低掃描CCD 的幀速率通常不高，因此，除非樣品的亮度*，在低曝光條件下信噪比會(huì)很低。這些因素都限制了CCD 在高速成像中的應(yīng)用（30幀/s），并是樣品成像變得令人挫敗。另外還需避免光漂白及光毒性，一些產(chǎn)品在拍攝時(shí)可以在細(xì)胞活性與亮度之間取得平衡。處于以上考慮，相機(jī)應(yīng)無(wú)光閘，具幀轉(zhuǎn)移或插值傳感器，這樣除了低速數(shù)字信號(hào)掃描外，可以持續(xù)地在錄像速率下拍攝圖像。在熒光探針亮度很低或量子產(chǎn)量很低等極弱光條件下，如果要求高速成像，可選擇增益型或電子擴(kuò)增型CCD。